基于群体混合分离分析法和RNA-seq技术筛选与克隆油菜耐渍相关基因

Brassica napus L., one of the most important oilseed crop, experiences waterlogging stress during direct sowing in paddy field planted as rotation crop following rice in the middle and lower Yangtze River area in China in rainy season, leading to yield losses. There is limited information about the transcriptome in Brassica napus L. under waterlogging and genetic basis of waterlogging tolerance is largely unknown..In this study, based on the constructed RIL (recombinant inbred line) population (zhongshuang9，tolerant material × GH01, sensitive material), waterlogging tolerance is to be evaluated for all the lines at both the seed germination stage and seedling growth stage. The transcriptome under waterlogging treatment (0h, 1h, 4h, 12h and 24 h) using the technique of RNA-seq is to be assayed in two near-isogenic pools constructed with waterlogging tolerant and sensitive individuals from the RIL population mentioned above. Differentially expressed genes are to be identified by comparative analysis among the transcriptome under different timepoints of waterlogging and between that of waterlogging-tolerant pool and the sensitive one..The goal of this study is to identify genes responding to waterlogging and to reveal the molecular basis of waterlogging tolerance by reverse genetics approach. Important candidate genes might provide new strategies to improve waterlogging tolerance of rapeseed.

油菜是世界上最重要的油料作物之一，在我国主要分布于长江流域，在该地区由于水旱轮作生产方式以及春秋多雨等气候原因已经使渍害成为油菜高产、稳产的重要制约因子。目前有关油菜淹水胁迫下的表达谱研究还未见报道，在转录水平上油菜对淹水胁迫应答的分子机理仍不甚明了。本研究拟以构建的重组自交系群体（耐渍材料中双9 × 敏感材料GH01）为基础，通过发芽期和苗期室内耐渍性鉴定和苗期田间模拟渍害鉴定相结合全面评价群体的耐渍性，挑选极端耐渍和敏感植株构建近等基因混合池，结合群体混合分离分析策略和高通量的RNA测序技术，进行不同淹水时期（0h，1h，4h，12h和24 h）胁迫下的全基因组范围的表达谱分析，在转录水平上阐明油菜对淹水胁迫的分子响应机理，通过表达基因在处理不同时间点的纵向比较以及抗敏近等基因混合池之间的横向比较，筛选油菜耐渍相关的基因，为培育耐渍油菜新品种提供理论基础和基因资源。

渍害和干旱、盐渍、异常温度共同影响着全球的物种分布和产量。油菜是世界上最重要的油料作物之一，渍害已经成为油菜高产、稳产以及扩大种植面积的重要制约因子。.本研究旨建立简便有效的油菜耐渍鉴定体系，筛选耐渍油菜种质资源并利用反向遗传学的研究策略，筛选油菜在淹水胁迫过程中差异表达的基因，揭示油菜在淹水胁迫下适应性应答的分子机制，取得的主要研究结果如下：.1．成功建立了油菜品种耐渍性筛选体系.对淹水胁迫下田间收获期产量及相关性状的考察以及室内发芽期和苗期性状的考察，以耐渍指数作为耐渍性评价标准。研究结果表明在发芽期和苗期进行耐渍性鉴定以预测在田间收获期产量的耐渍性。.2. 完成270份材料的耐渍性鉴定，筛选到了多份极端耐渍和敏感材料。.采用室内耐渍性快速鉴定方法对不同来源的270份油菜进行耐渍性鉴定，筛选耐渍材料。研究结果为充分利用油菜种植资源，指导油菜耐渍品种选育提供了一定的理论依据。.3. 对筛选到的耐渍材料中双9和GH01进行了淹水胁迫下的表达谱分析。.选取淹水处理后12h以及正常条件的幼苗根系进行RNA sequencing分析，筛选在淹水胁迫12小时的差异表达基因。结果表明，在淹水胁迫下基因表达受到多个层次的调控，包括转录调控，转录后调控，翻译调控以及翻译后调控包括磷酸化调控以及蛋白质降解平衡调控。目前一些重要候选基因正在进行转基因验证。.4、筛选获得了重要候选基因Bn-bHLH.通过表达谱分析获得了一个重要基因，其编码序列具有典型的转录因子bHLH结构域，命名为油菜螺旋-环-螺旋蛋白基因（Bn-bHLH，basic helix-loop-helix family protein ）。该基因在中双9中表现为受淹水诱导，而在GH01中则为抑制表达，此外在6个不同耐渍性的材料中检测其表达量，在抗性品种中均表现为诱导表达，而在敏感材料中则表现为抑制表达或表达量基本维持不变，进一步功能验证正在进行当中。