联合RNAi和激活宿主抗病毒天然免疫反应的双功能siRNA抗HBV作用及其分子机制研究

慢性HBV感染的有效治疗是医学领域中尚未攻克的一个重要难题。HBV抑制或逃避机体免疫反应是导致慢性感染和目前药物治疗不彻底的主要机制之一。我们前期研究发现：结合RNAi和特异性激活宿主IFN抗病毒天然免疫反应的siRNA分子具有显著抑制HBV活性。基于此，本项目针对慢性HBV感染的有效治疗这一尚未解决的问题，提出"应用联合RNAi和特异性激活宿主抗病毒天然免疫反应的双功能siRNA（3p-siRNA）抑制HBV"的科学设想，围绕"双功能siRNA抗HBV作用及其分子机制"这一科学问题，在细胞和实验动物水平上深入研究：针对HBV不同靶位点的双功能siRNA抗HBV作用及其机制；双功能siRNA对RIG-I介导抗病毒天然免疫反应的作用及其抗HBV分子机制。课题为设计新的抗HBV药物，寻找新型抗HBV治疗策略以及阐明抗病毒天然免疫在慢性HBV感染中的分子机制提供理论基础。

本项目通过三年实施，已完成了全部研究内容，取得了一些重要发现和研究成果。本研究通过一系列实验发现，针对HBV基因组特定序列设计并通过体外转录法制备5’-ppp-siRNA（3p-siRNA）同时具备了激活宿主细胞抗病毒天然免疫与特异性抑制HBV基因组复制的双重功能，对HBV感染的细胞及动物模型都具有双重保护作用。第一，3p-siRNA对HBV感染的HepG2.2.15细胞内HBV病毒基因组的复制具有特异性抑制作用。抗病毒活性测定发现，3p-siRNA能够降低HepG2.2.15细胞HBV DNA的复制水平以及HBV mRNA、HBsAg和HBeAg的表达水平；3p-siRNA在50nmol/L-200nmol/L剂量范围内对HBV病毒复制的抑制作用随剂量的升高而增强；在作用48小时-144小时的时间范围内，3p-siRNA对HBV病毒复制的抑制作用以48小时抑制作用最强，但可以持续至144小时；与普通siRNA抗HBV活性相比，3p-siRNA表现出更明显的抗病毒活性。第二，3p-siRNA能够激活HepG2.2.15细胞内I型干扰素（IFN）的表达，并且这种作用依赖于细胞内天然免疫识别受体RIG-I；3p-siRNA能够激活HepG2.2.15细胞内IFN-启动子活性，而在与RIG-I受体活性结构域共同转染的情况下，这种对IFN-启动子的激活作用显著增强，提示在HepG2.2.15细胞内3p-siRNA具有RIG-I依赖性激活宿主抗病毒天然免疫反应的作用；3p-siRNA对干扰素刺激调控元件（ISRE）也具有RIG-I依赖的激活效应。第三，3p-siRNA对于HBV感染的小鼠模型具有激活抗病毒天然免疫和抑制HBV病毒复制的双重保护作用。利用尾静脉水动力注射法建立HBV感染小鼠模型；对该模型实施3p-siRNA治疗，结果发现，一方面，3p-siRNA能够显著激活受试小鼠体内的抗病毒天然免疫反应、提高IFN-β的分泌水平；另一方面，3p-siRNA显著抑制受试小鼠血清中HBV DNA的拷贝数和HBsAg的表达，并且3p-siRNA抑制效果优于普通的HBV-siRNA；3p-siRNA与普通的HBV-siRNA均对HBV感染小鼠的体重无显著影响。本课题对设计新的抗HBV药物，寻找新型抗HBV治疗策略及阐明抗病毒天然免疫在慢性HBV感染中的分子机制等具有重要理论意义。