黄瓜CsMLO2基因对根结线虫侵染的免疫负调分子机制研究

To date, no Meloidogyne incognica (southern root knot nematode) resistance have been reported in the cultivated cucumbers. Loss of function of susceptible gene in cucumber is a new way for nematode resistance breeding. In this proposal, we focus on the negative regulation role of the cucumber CsMLO2 gene which may interact with M. Incognica effectors. First, loss and gain of CsMLO2 in the susceptible cucumber plants will be carried out by RNAi and CRISPR/Cas9 technology. Second, the effector in M. Incognica which may interact with CsMLO2 will be screened by membrane two-hybrid assay. The down-stream cucumber targets of CsMLO2 in the signaling pathway are investigated by the same method. The genetic mechanism of CsMLO2 that negatively regulate the cucumber immunity may arouse the light of using susceptibility genes in the cucumber breeding and develop the broad-spectrum and durable resistance against M. incognica.

栽培黄瓜资源中缺乏南方根结线虫抗性材料，利用感病基因功能丧失创制黄瓜抗根结线虫抗源材料，是黄瓜抗根结线虫育种的新策略。本项目拟围绕黄瓜CsMLO2基因对根结线虫侵染的免疫负调遗传机制，利用发根农杆菌介导黄瓜CsMLO2基因RNAi敲低和CRISPR/Cas9敲除转化须根系统，验证CsMLO2基因参与根结线虫侵染黄瓜感病反应调控功能；以膜受体CsMLO2为诱饵，采用细胞膜分裂泛素酵母双杂交技术，筛选鉴定CsMLO2膜受体感应南方根结线虫互作效应子蛋白，以及效应子信号传入细胞内后与其互作激活的靶标蛋白，从而解析膜受体CsMLO2蛋白接受并向细胞内传导根结线虫效应子信号途径，阐明黄瓜CsMLO2基因对根结线虫侵染的免疫负调遗传机制。以上创新性成果的获得对于丰富植物对根结线虫免疫学理论和发展黄瓜持久广谱抗性遗传控制新技术均具有重要意义。

栽培黄瓜资源中缺乏南方根结线虫抗性材料，利用感病基因功能丧失创制黄瓜抗根结线虫抗源材料，是黄瓜抗根结线虫育种的新策略。本研究从黄瓜基因组中克隆了14个MLO家族基因，与拟南芥MLO基因构建的系统演化树表明，黄瓜与拟南芥的MLO基因家族一一对应，可以分为4个类群。构建了拟南芥MLO突变体库，对MLO突变体接种南方根结线虫的实验表明，单突变株（Atmlo1、 Atmlo2-5、Atmlo6-2 、 Atmlo7、Atmlo8、 Atmlo9、Atmlo12），双突变株（Atmlo2 /Atmlo12 ）和 三突变株（Atmlo2 /Atmlo6/ Atmlo12 ）的株系根结数显著性减少，表明这些拟南芥的MLO基因参与根结线虫对寄主的侵染过程。对不同接种南方根线线虫时期的黄瓜，进行14个黄瓜MLO基因进行动态荧光定量分析，结果显示CsaMLO1, CsaMLO11, CsaMLO13和CsaMLO14在接种后三天内表达量与对照相比表达显著上调，表明这些黄瓜的MLO基因与根结线虫的侵染相关；构建拟南芥表达载体，把黄瓜MLO同源基因转到相应拟南芥突变体中，进行性状互补试验，利用T1代植株进行南方根结线虫抗性鉴定试验。结果显示黄瓜MLO基因CsaMLO1互补到其同源性最高的拟南芥突变体 Atmlo12 后根结数量明显增多，表明CsaMLO1是一个感根结线虫的基因。CsaMLO1，CsaMLO8和CsaMLO11 基因亚细胞定位表明这三个基因位于细胞膜上。 目前已经成功的构建了CsaMLO1，CsaMLO8和CsaMLO11基因编辑载体，相关的功能研究正在进行中。该对于进一步理解线虫的致病机理，以及根结线虫的防治及黄瓜抗根结线虫育种均具有重要的意义。