TLR4 mRNA 3'未翻译区相关microRNA的鉴定及在婴幼儿喘息中的作用研究

RSV是引起婴幼儿喘息最常见的病原，然而其感染后的临床表现却存在较大差异。国外研究表明TLR4基因单核苷酸多态性（SNP）与RSV易感性及感染后不同临床表现有关。TLR4基因3'未翻译区（3'-UTR）11367位点SNP于2007年首次在中国汉族人群中被发现，本课题组前期对该位点SNP在喘息和正常儿童中的分布及与临床表型的关系进行的初步研究发现，单用此TLR4基因 SNP不足以解释所观察到的临床现象，故而想到对TLR4基因3'-UTR起重要调控作用的miRNA，可能在婴幼儿RSV感染后临床表型中起重要作用的新观点。且本课题组目前已首次检测到与TLR4mRNA3'-UTR结合的miRNA的真实存在，具有很好的创新性。在前期研究的基础上，本课题将进一步验证miRNA对TLR4 mRNA 3'-UTR调控作用，及探讨该调控机制在RSV感染后婴幼儿喘息中的作用与价值,具有十分重要的理论意义。

本课题基于前期研究提出TLR4基因3'-UTR SNP 11367位点附近可能存在相关miRNAs在转录后水平调控TLR4基因的表达，进而在婴幼儿RSV感染后喘息中发挥重要作用的观点。因此第一部分实验我们利用Targetscans等生物学软件预测出可能靶向结合TLR4基因3'-UTR 11367附近位点的miRNAs（hsa-miR-891b、629和433）,并利用荧光定量PCR方法证实三者的存在。但是利用pmiR-RB-REPORT™ TLR4 3'-UTR双荧光素酶报告基因系统，却发现hsa-miR-891b、629或433对TLR4 3'-UTR无明显的靶向调控作用。此结果与预期假设并不完全吻合，推测可能与这三条miRNAs与靶基因的结合能力较低继而影响了对靶基因的调控等因素有关。经过查阅文献及分析前期研究，我们及时调整实验计划为：以TLR4 SNP和TLR4 mRNA 相关miRNAs为着手点，通过体外实验和临床随访分别探讨两者在婴幼儿RVS感染中的作用及机制。因此第二部分实验收集了400例因RSV感染住院婴幼儿的临床资料和标本，排除了早产、先天性心脏病、营养不良、贫血及合并其他病原感染等因素后，筛选出67例仅因RSV感染且为初次喘息者，其中34例合并呼吸衰竭，33例不伴呼吸衰竭。同时收集了96例无住院病史的健康儿童作对照。通过对患儿TLR4全外显子区的基因测序，与对照组比较发现TLR4基因SNP rs41426344位点与婴幼儿RSV感染后临床严重程度密切相关。第三部分实验我们首先通过基因芯片及生物学软件筛选出RSV感染状态下可能与TLR4 3'-UTR相关的miRNA-145、449a、197，并且在体外RSV感染气道上皮细胞中证实miRNA-145与TLR4 mRNA的表达密切相关。然而利用pmiR-RB-REPORT™ TLR4 3'-UTR检测却发现miRNA-145对TLR4 3'-UTR无直接的靶向调控作用。结果提示：在RSV感染状态下miRNA-145与TLR4 基因关系密切，遂两者无直接靶向调控关系，其可能是存在其他调控机制，这或许是以后我们需要研究的方向。第四部分实验随访因RSV感染住院婴幼儿出院后2年再发喘息情况，我们发现TLR4基因SNP虽与婴幼儿RSV感染后临床严重程度密切相关，但却无明显增加RSV感染住院婴幼儿再发喘息的危险性。