内脏副交感神经异化修复对膈肌神经肌肉接头重新支配的实验研究

High cervical spinal cord injury often caused functional loss of phrenic nerve. With no innervation, diaphragm can’t perform voluntary breath. Patients could only live with the help of respirator. Heterogenic repair could also regain functional recovery in newborn nervous conduct after anastomose with different nerves. Heterogenic repair has been proved to be feasible in the model of artificial reflex pathway. However, the mechanism of respiratory functional recovery in diaphragm during heterogenic repair remains unclear. Our previous study revealed that the distribution of neuromuscular junction in skeletal muscle has regular pattern, and this distribution pattern may affect the respiratory functional recovery. Therefore, we will establish experimental models in which the anastomose will be performed between vagus nerve and phrenic nerve. The number of axon, nerve conductive velocity of heterogenic nerve, electromyography of diaphragm, gene (Chrnb, Chrnd, Chrng, Chrne) and protein expression of different subtypes (α, β, δ, γ, ε) of neuromuscular junctions, morphology and distribution pattern of neuromuscular junctions will be dectected to explore the mechanism of reinnervation during heterogenic repair. This study is of great significance to clarify the mechanism of neruomuscular junction reinnervation during heterogenic repair, providing reference to improve outcome of respiratory reconstruction after cervical spinal cord injury.

高位颈髓损伤常致使膈神经功能丧失，膈肌失去神经支配后，无法主动收缩维持呼吸功能，患者仅能依赖呼吸机等辅助设备维持生命。异化修复将不同性质的神经进行对接，使近端神经再生轴突通过吻合部位，长入末梢效应器，建立有效的神经传导通路。人工反射弧通路已证实异化修复可行，但异化修复过程中膈肌功能重建机制尚不明确。我们前期研究发现神经肌肉接头在正常骨骼肌内分布存在一定规律性，这种规律可能与膈肌呼吸功能相关。本研究拟用SD大鼠建立内脏副交感神经异化修复膈肌的动物模型，观察吻合段神经的神经纤维数量和传导速度、膈肌肌电图、神经肌肉接头不同基因（Chrnb, Chrnd, Chrng, Chrne）和亚基（α, β, δ, γ, ε）蛋白表达、神经肌肉接头的单一形态与整体分布规律，探讨内脏副交感神经异化修复躯体运动神经过程中膈肌神经肌肉接头的重新支配机制, 为将来促进高位颈髓损伤重建呼吸功能的治疗效果提供参考。

高位颈髓损伤常致使膈神经功能丧失，膈肌失去神经支配后，呼吸功能受到影响，如何重建膈肌功能仍是一个临床难题。而神经的异化修复可将不同性质的神经进行对接，使近端神经再生轴突通过吻合部位，长入末梢效应器，建立有效的神经传导通路。因此，在前期研究工作的基础上，课题组建立了迷走神经异化修复膈神经的实验动物模型并与膈神经自身修复比较，通过本课题的研究，取得如下结果：1.小鼠的迷走神经和膈神经在锁骨平面并行一段距离，重叠距离约为2mm，能够有效地进行显微吻合，降低神经张力，在切断和吻合过程中，实验动物生命体征平稳，未出现呼吸心跳骤停及死亡，是神经异化修复模型的理想窗口区域；2.提出了膈肌神经肌肉接头的整体标记显像方法，突破了传统免疫组织化学方法对标本要求的限制，可以高效、快速的进行神经肌肉接头的标记，结合荧光显微镜得到正常小鼠膈肌神经肌肉接头的整体分布规律；3.结合膈肌神经肌肉接头的整体标记显像方法，迷走神经异化修复膈神经与正常膈肌相比，神经肌肉接头的分布规律未发生改变，神经异化修复后原位重新支配神经肌肉接头。4.神经异化修复后膈肌神经肌肉接头的不同基因（Chrnd, Chrng, Chrne）和亚基（α, β）蛋白表达与膈神经自身修复相比，除术后3月时间点，其他时间点无显著性差异；5.神经异化修复后的血气分析提示氧分压、二氧化碳分压和pH值与膈神经修复、正常对照无明显差异，呼吸功能恢复。上述实验结果证明了迷走神经可以异化修复膈神经，恢复膈肌功能，为临床应用提供了理论学依据。阐明了神经异化修复后重新支配膈肌获得了完整的分子、组织和功能基础，为靶器官和神经中枢功能重塑研究提供新的方向。