CsWHY2基因调控黄瓜线粒体父系遗传的作用和机制研究

Study of mitochondrial inheritance has great significance for heterosis utilization and mitochondrial evolution. The vast majority of angiosperm shows the maternal inheritance of mitochondria, but cucumber shows the paternal. Our preliminary study results show that the mitochondrial DNA of cucumber generative cells were protected and inhibited the degradation of nuclease is the main mechanism of mitochondrial paternal inheritance. Furthermore, the CsWHY2 is involved in protection of mitochondrial DNA in vitro, but the role and mechanism of CsWHY2 gene regulated the paternal inheritance of mitochondria is not clear. With those progress newly made, the project proposed herein aim at the functional analysis of CsWHY2 by cucumber protoplast transient expression system and specific expression RFP/GFP in Arabidopsis vegetative cells and sperm cells system. And elucidate the patrilineal genetic mechanism by tracing the mitochondrial origin of F1 hybrids and mitochondrial metabolism with transformation technique. Expected results would elucidate the mechanism of CsWHY2 gene regulated paternal transmission of the mitochondria in cucumber, and further reveal the protection mechanism of mitochondrial DNA, which could have the important guiding significance for the study of molecular non-Mendelian genetic mechanism in angiosperm.

线粒体遗传机制研究对于杂种优势利用以及线粒体进化等都具有重要的意义。绝大多数被子植物线粒体为母系遗传，而栽培黄瓜线粒体为父系遗传。我们前期研究已发现黄瓜父系遗传是在生殖细胞中存在抑制核酸酶对线粒体DNA降解的机制，而黄瓜拟核蛋白CsWHY2基因参与了这一过程，防止线粒体DNA被降解。但是CsWHY2调控线粒体父系遗传的具体作用和机理尚不清楚。本项目在申请者前期对线粒体研究建立的黄瓜原生质体瞬时表达体系、拟南芥特异表达RFP/GFP体系的基础上，采用RNA、蛋白定量分析等方法，研究花粉发育过程中CsWHY2在调控生殖细胞线粒体DNA的具体作用；结合转基因技术，分析杂交F1线粒体DNA来源，明确CsWHY2对线粒体遗传的调控。研究结果将探明CsWHY2在黄瓜线粒体父系遗传中的分子调控机理，揭示父系遗传中生殖细胞线粒体DNA的保护机制，对于被子植物非孟德尔遗传的分子调控机理研究具有重要指导意义。

本项目在明确黄瓜线粒体遗传调控细胞学机制的基础上，从线粒体拟核蛋白出发，深入开展黄瓜线粒体父系遗传机制研究。项目克隆了黄瓜CsWHY2基因并进行基本生物信息学分析，利用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术取代Western blot 技术，通过对花粉发育中单核靠边期、贴壁期、变圆期、成熟期等四个不同发育时期总蛋白的提取，构建了花粉蛋白文库并进行了差异蛋白的挖掘和表达分析，结合已有黄瓜线粒体DNA拷贝数在花粉不同发育时期的变化规律以CsWHY2的表达变化，研究了CsWHY2在花粉发育不同时期的转录、表达与线粒体DNA拷贝数之间的内在联系。利用瞬时表达系统和融合表达载体的构建，完成了该基因编码蛋白的亚细胞定位，用MitoTracker Red线粒体特异性染液和叶绿体自发荧光，确定线粒体和叶绿体的位置，明确了其在线粒体中发挥作用。以花粉特异性启动子Lat52启动的p1301s-Lat52-CsWHY2过表达载体为基础，分别构建了proCsDPD1-CsWHY2、proCsWHY2-CsWHY2植物表达载体，开展在拟南芥的遗传转化，并尝试通过农杆菌侵染子叶节的方法转化黄瓜品种“长春密刺”，达到验证黄瓜CsWHY2基因功能的目的。.此外，项目基于拟南芥异源表达，通过花粉DAPI染色和RT-qPCR，深入研究了黄瓜CsWHY2基因在拟南芥花粉发育过程中对花粉线粒体DNA拷贝数及线粒体编码相关基因表达的影响，初步明确了黄瓜CsWHY2基因对花粉线粒体DNA的保护作用。项目通过优化体系建立了黄瓜叶片线粒体及其DNA的有效方法（已申请专利），用于线粒体测序及后续研究；首次开发了基于黄瓜线粒体基因组的特异性线粒体SSR标记（mtSSR），可用于种子纯度检测。项目初步明确了黄瓜CsWHY2基因在花粉发育中的功能及其调控机理，为阐明黄瓜线粒体父系遗传的分子机制，完善线粒体遗传机制研究奠定了理论基础。