霍乱弧菌AphB蛋白对氧趋化的调控机制研究

Vibrio cholerae is the causative agent of the diarrheal disease cholera. The virulence regulatory pathways of V. cholerae have been extensively studied in vitro. AphB, a key virulence activator in V.cholerae, is a lysR family transcriptional activator and can regulate different genes expression. We have demonstrated that only under oxygen-limiting conditions, an environment similar to the intestine, AphB can activate the key virulence regulator TcpP expression. We also found that AphB can repressed V.cholerae aerotaxis, and aerotaxis plays a very important role in colonization. To demonstrate how anaerobisis affectes AphB function and how AphB subsequentially regulates downstream genes expression which are involved in aerotaxis would help us to understand how V.cholerae survives in the intestine by changing its gene expression profile according to different living environment. In this application, we will use protein biochemical analysis, gene knock-out, genetic screening and other approaches to further study how V.cholerae modifies AphB activity by sensing oxygen, and then find out which genes related to aerotaxis would be regulated by AphB. By studying the upstream and downstream regulatory network of AphB, we try to elucidate the mechanism how AphB regulates aerotaxis in V.cholerae. These studies will thus allow us to gain a fuller understanding of the bacteria-host interactions that have allowed V. choleraeto become such a successful human pathogen.

霍乱弧菌是人类重要的肠道病原菌，但是对于该病菌如何在肠道中定植从而引起霍乱一直没有研究清楚。AphB是霍乱弧菌毒素基因表达重要的调控蛋白。前期研究发现，霍乱弧菌毒素基因调控蛋白AphB的功能受到氧气浓度的影响，而且对霍乱弧菌的氧趋化性有抑制作用。氧趋化性对于霍乱弧菌在肠道内正确的位置进行定植是至关重要的。因此，本项目将通过基因敲除、蛋白功能分析、基因定向筛选和小鼠肠道体外分析模型、荧光标记等方法，研究AphB的功能是如何被氧气浓度调控，哪些蛋白因子影响AphB的功能；另一方面，研究AphB是如何调控霍乱弧菌的氧趋化性，以及这些调控机制是如何影响霍乱弧菌在肠道中的定植和致病。通过本项目的研究，以AphB蛋白调控为中心，深入研究霍乱弧菌毒素基因表达及氧趋化性的调控网络，阐明霍乱弧菌在肠道中成功定植的分子机制。

霍乱弧菌是引起人体肠道急性腹泻（霍乱）的主要肠道病原菌，霍乱弧菌能在小肠内的定植并引起腹泻需要表达一系列的毒素基因，霍乱弧菌中毒素基因的表达受到严格的调控，而各种环境因子的相互作用是这些毒素基因表达调控的关键。我们前期的研究发现，毒素基因表达的重要调控蛋白AphB在氧气浓度低的条件下，才能结合下游调控蛋白TcpP的启动子区，从而启动TcpP蛋白的表达。然而，氧浓度究竟是如何影响AphB蛋白的活性，其分子机制尚不明确。本项目通过通过错配PCR构建AphB蛋白突变子文库，筛选对氧浓度耐受的突变子，筛选得到3株在有氧条件下仍然具有诱导活性的AphB突变株，分别是AphB S267V, AphB M244A和AphB M113A。对这3个突变株的表型分析发现，这3个突变位点很可能不是通过影响AphB二聚体形成的功能，而是通过影响AphB与底物分子结合的效率从而使得蛋白的诱导功能发生改变。另外，通过构建大肠杆菌双杂交突变子文库，我们筛选到一段非编码RNA（vad1）对AphB二聚体的形成具有促进作用。对霍乱弧菌氧趋化性分析发现，AphB很可能通过抑制与趋化性相关的基因（如NQR基因簇、VCA0186等）的表达，从而抑制霍乱弧菌的氧趋化性，这也是霍乱弧菌适应生活环境变化的一种调控作用。关于AphB对霍乱弧菌氧趋化性的调控机制仍然有待进一步的研究，我们将通过在霍乱弧菌野生型菌株和aphB基因缺失菌株中检测其它与氧趋化性相关的基因的表达水平，确定AphB究竟通过直接调控那个基因的表达，从而影响霍乱弧菌的氧趋化性。阐明AphB影响霍乱弧菌的氧趋化性的分子机制，将扩充我们对霍乱弧菌如何侵染宿主的分子机制的认识，同时也将为研究治疗霍乱疾病提供新的思路。