华癸中生根瘤菌7653R共生固氮新基因dmtH的鉴定和功能研究

本研究基于前期工作基础，以华癸中生根瘤菌7653R共生固氮相关新基因dmtH为研究对象。拟根据同源基因设计适当引物，通过PCR 方法克隆目标基因的完整序列。并构建dmtH基因插入失活的华癸中生根瘤菌7653R稳定突变体，结合功能互补研究该基因在共生固氮过程中的功能。进一步完成dmtH基因的超表达、蛋白纯化和转甲基酶活性体外测定。最后采用实时荧光定量PCR技术，比较研究该基因在共生（类菌体）和自生（根瘤菌）条件下的时空表达特征。从而获得直接有力的实验证据阐明该新基因参与类菌体和共生体分化、固氮及根瘤早衰的功能机制。..本申请项目的预期完成可为持续、深入地研究类菌体能量代谢和探究其电子传递新途径打下良好的工作基础。也将为类菌体（共生）和根瘤菌（自生）生理代谢和固氮基因表达的差异研究领域提供一些新进展。

根瘤菌具有复杂的分支电子传递网络以适应不同生活环境。一般认为根瘤菌以泛醌（UQ），而不是甲基萘醌（MK），作为电子传递载体。基于前期工作中已构建的华癸根瘤菌7653R基因组 Tn5转座子突变体库，本项目克隆与鉴定出共生固氮相关新基因dmtH，分析预测其编码去甲基甲基萘醌（DMK）甲基转移酶，催化MK的生物合成。为研究dmtH的共生固氮功能，本项目构建了dmtH插入失活突变株HK116，结果表明突变株HK116与宿主植物紫云英共生时形成无效根瘤；竞争结瘤能力降低；类菌体数量及形态结构发育异常；PHB积累。互补菌株能够恢复HK116的共生表型。上述结果确证了dmtH为7653R共生固氮所必需。dmtH突变对7653R生长代时、形态和碳源利用等自生培养时的生理特性无影响，但显著影响微氧条件下的聚-β-羟基丁酸（PHB）代谢。荧光定量PCR检测表明dmtH在类菌体中呈共生诱导、特异性表达特征。对7653R和突变株HK116中的醌组分进行了提取，高压液相色谱与质谱鉴定分析发现：好氧培养时7653R仅积累UQ-10；微氧培养时则合成MK，但HK116中却无甲基萘醌产生。结果表明7653R类菌体在共生固氮条件下以甲基萘醌MK作为特异的呼吸电子传递载体。利用大肠杆菌ubiE突变株细胞抽提物作为反应底物进行了体外酶活测定，发现在酶促反应产物的醌提取物中确实具有MK-8产物的形成。结果表明DmtH蛋白能够催化SAM转移甲基至DMK，从而合成MK，具有转甲基酶活性。本项目首次阐明7653R在共生固氮时可以MK作为电子传递载体；揭示了dmtH突变导致类菌体呼吸产能受阻、发育异常，从而无法行使共生固氮功能的作用机制。本项目研究结果为类菌体生理代谢及固氮基因的差异表达研究领域提供了创新进展；为深入探究类菌体电子传递新途径奠定了良好的工作基础。