间充质干细胞分泌因子通过微囊泡介导精原干细胞对抗白消安损伤的实验研究

Incidence of male infertility is still high. Cancer and anti tumor treatment lead to the male subfertility, and result in gonadal dysfunction and reproductive insalubrity potentially. Exploring the protective effects of factors secreted by stem cells on spermatogenesis would help to develop the new strategies of spermatogenesis protection besides of sperm cryopreservation and hormone therapy and to understand the mechanism of spermatogenesis impairment. This study investigates the protective modes of factors secreted by mesenchymal stem cells (via microvescles) on busulfan-induced spermatogenesis impairment,especially on the niche of spermatogonial stem cells partially provided by blood-testis barrier. And then analyze the effects of different factors on the proliferation, differentiation and meiosis of spermatogonial stem cells. We also observe the impact of different factors on testicular secretion function. Our results hope to provide new data for fertility preservation and reproductive function, with promising value of application.

男性不育症发病居高不下。癌症及抗肿瘤治疗是造成男性生育力下降的重要原因，也潜在影响性腺功能和生殖健康。探索干细胞分泌因子对生精功能的保护，能够开展精子冷冻和激素干预生精损伤之外的新的治疗思路以及促进对精子发生障碍机制的认识。本课题拟以微囊泡为切入点，探讨骨髓间充质干细胞分泌因子对抗细胞毒性药物白消安致生精损伤的作用方式，特别是组成精原干细胞微环境的重要结构—血睾屏障完整性；分析分泌因子及不同成分在生精损伤过程中对精原干细胞的增殖、分化潜能、减数分裂等生物学特性的影响；观察不同成分分泌因子对睾丸分泌功能的影响。本研究为男性生育力保存、生殖功能的维护提供实验数据，具有重要的应用价值。

男性不育因素约占不孕症的40%，抗肿瘤治疗、环境因素等是造成男性生育力下降的重要原因。干细胞治疗作为一种新型的治疗手段，应用前景广阔。前期研究发现骨髓来源间充质干细胞具有强大的自我更新及旁分泌功能。因此探索其分泌因子对化学性生精损伤的的保护作用，可能有望为生育力保护提供新的有效的治疗策略。.课题组成功从骨髓间充质干细胞培养分离得到微囊泡， NTA检测平均粒径135.8nm，透射电镜下呈圆形或椭圆形，有完整胞膜结构，内含低密度物质。WB结果显示显著表达特异性CD90、CD73、CD44和 CD105，表明获得微囊泡为后续研究提供了良好的基础平台。我们以40 mg/kg剂量白消安单次腹腔注射BALB/c小鼠，建立了化学性睾丸生精损伤模型，再持续注射微囊泡，取睾丸组织完成了生精功能相关指标检测，诸如血睾屏障及细胞黏附基因的表达实验、精原干细胞的生物学特性实验等。结果发现骨髓间充质干细胞分泌微囊泡能够明显减少小鼠化学性睾丸生精损伤，表现在间充质干细胞微囊泡能够阻抑血睾屏障及细胞黏附基因N-cadherin、P-cadherin和ICAM-1的下调，可能通过ICAM‐1–N‐cadherin–β‐catenin蛋白复合体的形式维持血睾屏障的完整性。其次在动物水平微囊泡促进损伤后精原细胞减数分裂基因（Stra8, Piwi, Cylin A1）的表达。第三，在睾丸水平干细胞微囊泡促进了生精上皮细胞的增殖能力，包括生精上皮基底层精原细胞。我们进一步分析发现间充质干细胞微囊泡能够明显增强精原干细胞的自我更新能力，促进OCT、GDNF、Bcl6b、Erm5表达，而不增加其分化，如C-kit、Ngn3、Sox2表达没有明显增加。其他可溶性分泌因子以及293细胞微囊泡并没有明显的保护作用，从而证实干细胞分泌作用通过微囊泡的形式发挥对化学性生精损伤的保护作用，可能通过促进ICAM‐1–N‐cadherin–β‐catenin复合体修复血睾屏障，通过调控GDNF 信号通路激活 Etv5 基因及其下游基因 Bcl6b，增强精原干细胞的自我更新能力，抑制精原干细胞分化。. 实验初期由于化学损伤后离体精原干细胞扩增困难，数量少，不能得到足够检测的干细胞数量，因此我们尝试对在体损伤精原干细胞的特异性分子进行检测，得到以上数据。