基于抗原模拟肽信号放大的有机磷农药多残留高灵敏快速免疫分析方法的研究

Organophosphorus pesticides（Ops）residues in food are characterized variety and trace. Immunoassays for single-Ops are not suitable for high-throughput screening of Ops multi-residue in samples. Moreover, there are some pronlems in current multi-residue immunoassays of Ops, such as complex operation and low sensitivity. In this study, aiming at the above problem, a class-specific single-chain antibody immunomagnetic beads and mimotope-amplification module based immunoassay is developed. Firstly, immunomagnetic beads of Ops is prepared, and highly sensitive mimotopes are screened from the random peptide library and the secondary peptide library by phage display technology. Then, the phage display system is modified to prepare a phage capsid-based mimotope-amplification module. Finally, the magnetic nanoparticles-based chemiluminescence enzyme-linked immunoassay (MCLEIA) for Ops multi-residue is established based on the immunomagnetic beads and mimotope-amplification module. The developed immunoassay is used to the simple, rapid and high sensitivity detection of Ops residues in food. Moreover, the date of this study will provide a scientific basis for the establishment of sensitive and rapid immunoassay technology for other small molecule analytes.

有机磷农药在食品中的残留具有种类多、痕量等特点，针对单种有机磷农药的免疫分析方法无法实现大量样品中多种有机磷农药残留的快速筛查，而目前的有机磷农药多残留免疫分析方法又存在着检测步骤繁琐、灵敏度低等不足。本项目在已获得的有机磷农药类特异性单链抗体基础上，拟通过制备有机磷农药抗原模拟肽的信号放大模块和开发磁珠免疫分析方法来解决上述问题。首先，制备有机磷农药单链抗体免疫磁珠，并以其为靶标通过噬菌体展示技术对随机肽库及次级随机肽库进行筛选，来获得高灵敏度的抗原模拟肽；然后，通过改造噬菌体展示体系，制备基于噬菌体衣壳的抗原模拟肽信号放大模块；最后，利用免疫磁珠和抗原模拟肽信号放大模块，建立有机磷农药多残留的磁珠-化学发光酶联免疫分析方法（MCLEIA），实现食品中有机磷农药多残留的简单、快速、高灵敏度的检测，为建立小分子分析物高灵敏快速的免疫检测技术提供科学依据。

有机磷农药在食品中的残留具有种类多样、痕量等特点，因此，建立高灵敏度的有机磷农药多残留分析方法具有重要意义。本项目通过构建抗原模拟肽信号放大模块来建立高灵敏、快速的有机磷农药多残留免疫分析方法。首先，将有机磷农药宽谱特异性抗体与氨基磁珠偶联，制备了免疫磁珠，以免疫磁珠为靶标对噬菌体展示随机肽库进行筛选，获得了“初级抗原模拟肽”，在对其序列分析的基础上构建了次级肽库，并从中筛选获得了最佳抗原模拟肽p28（WWWTEPLPPT）。其次，构建了p28和Avi标签双展示的噬菌体KM13-p28-Avi，经生物素化修饰后，利用生物素与链霉亲和素的高亲和力，将链霉亲和素与HRP-BSA-Biotin先后装配到噬菌体表面，获得了抗原模拟肽p28信号放大模块（KM13-p28-HRP）。最后，建立了有机磷农药多残留直接竞争磁珠-化学发光酶联免疫分析法（MCLEIA）。MCLEIA对30种有机磷农药的平均IC50值为9.05ng/mL，平均交叉反应率为95.71%，较好的满足了有机磷农药多残留检测的需求。样品的添加回收试验结果表明该方法具有较好的准确性与稳定性。此外，该方法仅需一步20min的孵育步骤，大大简化了操作步骤和节约了检测时间。本研究为利用抗原模拟肽信号放大模块来建立高灵敏、快速的小分子分析物免疫分析方法提供了一定的科学依据。