生物合成牛磺酸的新型半胱亚磺酸脱羧酶的鉴定和特性研究

Taurine (2-aminoethanesulfonic acid), is one of the most abundant free β-amino acids and widely distribute in the animal kingdom that has been considered to be possibly involved in a long list of various physiological actions. Currently, cysteine sulfinate decarboxylase(CSD: EC 4.1.1.29), the enzymatic activity of which was first identified in the liver, is thought to be the rate-limiting step of taurine synthesis. The biosynthesis of taurine has been limited by the cysteine sulfinate decarboxylase activity.It's important to isolate novel cysteine sulfinate decarboxylases from environmental metagenome for the biosynthesis of taurine in vitro. This research project will focus on the novel csyteine sulfinate decarboxylase genes from environmental metagenome using genetic engineering technology.Firstly,the over-expression and purification in E.coli of the novel genes will be completed. Secondly, biochemical characterization and kinetic parameters analysis of the novel proteins will be completed under the substrate of cysteine sulfinic acid and cysteic acid, etc. Finally, the construction of the mutation library will be completed using error-prone PCR technology. The higher activity or the better mutation will be isolated. Based on the bio-information analysis and the functional comparison of the mutation enzyme, the relationship of function and the protein structure will be elucidated preliminarily.This project will be significant to explore the novel csyteine sulfinate decarboxylase genes resource from environmental metagenome, and also benefit to the possibility demenstration of the construction of the new biosynthesis technology for taurine using novel cysteine sulfinate decarboxylase.

牛磺酸是一种重要的非蛋白质类氨基酸，具有多种重要的生理功能作用。半胱亚磺酸脱羧酶（CSD，EC 4.1.1.29），被认为是生物合成牛磺酸途径中的限速酶，半胱亚磺酸脱羧酶活性的高低，直接制约牛磺酸的合成量。因此，分离新型半胱亚磺酸脱羧酶解决合成体系中酶活不高的难题非常重要。本项目拟以来自环境宏基因组文库的新型氨基酸脱羧酶为研究对象，基于酶基因的高效表达，以半胱亚磺酸盐等作为底物，完成新酶的生化性质鉴定和动力学参数分析；利用连续易错PCR技术构建突变酶库，分离半胱亚磺酸脱羧酶酶活更高或者其他酶学特性更好的突变酶；基于新酶和突变酶的功能比较，结合生物信息学分析结果，初步阐述新酶基因的结构和功能之间的关系。本项目的成功实施对于开发利用环境体系新型半胱亚磺酸脱羧酶的基因资源具有借鉴意义，对初步完成论证利用新酶的功能特性构建体外合成牛磺酸的生物工艺的可行性具有参考作用，因而具有重要的实践意义。

牛磺酸是一种重要的非蛋白质类氨基酸，具有多种重要的生理功能作用。半胱亚磺酸脱羧酶（CSD，EC 4. 1. 1. 29），被认为是生物合成牛磺酸途径中的限速酶，半胱亚磺酸脱羧酶活性的高低，直接制约牛磺酸的合成量。因此，分离新的半胱亚磺酸脱羧酶，或者完成酶的结构优化解决相关合成体系中酶活不高的难题非常重要。本项目基于序列特异性筛选策略和酶的功能分离筛选策略，从已构建的碱性土壤环境宏基因组文库中，分离得到了一个编码新的半胱亚磺酸脱羧酶的基因undec1A。undec1A由1077个碱基组成，编码一个由359个氨基酸组成的多肽，预测该多肽分子量大约为38 kDa。所预测的目的蛋白与一种来自于 Chlorobium phaeobacteroides BS1的脱羧酶具有较高的一致性（58%）。利用pETBlue-2表达载体，实现了undec1A基因在E. coli Tuner (DE3)pLacІ 细胞中的表达。利用液相色谱--质谱联用分析技术（LC-MS），证实了重组Undec1A蛋白催化 L-半胱氨酸脱羧生成 β-巯基乙胺。Undec1A 蛋白在pH 7.0 和 35 ℃下活性最高。表观米氏常数Km约为0.5928 mM，最大反应速率Vmax约为 68.5 μM/min，催化常数 kcat为4.57/min。PCR介导的定点突变技术研究结果揭示了突变Ser-113会导致Undec1A蛋白失去大部分活性；突变His-30会导致整个蛋白的失活，从而验证了它们所在的保守区域是Undec1A 蛋白的活性中心区域。研究结果证实了保守区域模式中的His-30 和Ser-113 是Undec1A蛋白表达活性所必需的氨基酸。以大肠杆菌表达系统为平台，以半胱亚磺酸等为底物，完成了未培养微生物来源的新的氨基酸脱羧酶的生化性质分析。利用连续易错PCR 技术完成突变酶库的构建，分离了一个编码半胱亚磺酸脱羧酶酶活更高的突变酶。基于新酶蛋白和突变酶的功能研究，结合相关突变酶的分子生物信息学分析结果，对新酶基因的结构和功能之间的关系进行了初步阐述。基于项目的经费支持，本研究还完成了系列氨基酸脱羧酶的基因资源的挖掘。本研究对于开发利用环境体系新的氨基酸脱羧酶的基因资源完成在食品和医学领域的应用基础研究具有理论参考意义，对完成论证利用新酶的功能特征构建体外合成牛磺酸的生物工艺的可行性具有重要的实践意义。