马唐生防菌活性成分ES-toxin生物合成关键基因鉴定及功能研究

The herbicidal activity secondary metabolites of weed biocontrol fungi play important roles in the process of their infection to the host，and they are the important sources of new bioherbicides. A highly pathogenic strain Epicoccum sorghinum was isolated from the malignant weed Digitaria sanguinalis, and a secondary metabolite ES-toxin with good herbicidal activity was discovered in the medium. The toxin is effective to control advanced leaf age D. sanguinalis and has the potential to develop into a bioherbicide. However, the biosynthetic pathway of ES-toxin remains unclear. ① This project is intended to screen of gene clusters for secondary metabolites synthesis preliminary by using bioinformatics analysis of E. sorghinum genome combining with toxin production dynamics and gene expression patterns. ② Gene knockout and complemented strains were constructed as experimental materials. Comparing the difference of toxin production between wild-type, gene knockout and complemented strains, the key genes for ES-toxin biosynthesis were identified. ③ Further, the biological characteristics, infection ability and response to external stress of wild type, gene knockout and gene complemented strains were investigated to elucidate the gene functions of key genes in ES-toxin biosynthesis. This project will lay a theoretical foundation for the bioherbicides development of ES-toxin and the construction of genetic engineering strains with high toxicity.

从杂草生防菌的次生代谢产物中筛选具有除草活性的化合物是生物除草剂研究的热点，而明确活性物质的生物合成途径是对其进行深层次研发的关键。ES-toxin是从马唐生防菌Epicoccum sorghinum中分离到的具有高除草活性的真菌毒素，对大龄马唐也有良好防效，具有开发为生物除草剂的潜力。但对ES-toxin的生物合成途径尚不明确，本项目拟：①通过生物信息学分析预测E. sorghinum基因组中代谢产物合成相关基因簇，结合毒素产生动态及所预测基因的表达模式，筛选与ES-toxin合成相关的基因；②构建候选基因的敲除和回补菌株，比较其与野生型菌株毒素产量的差异，确定ES-toxin合成关键基因；③通过比较野生型、基因敲除和基因回补菌株的生物学特性、侵染过程及对胁迫因子响应的差异，阐明ES-toxin合成关键基因的功能。研究结果将为构建稳定遗传的ES-toxin高产工程菌株奠定理论基础。

马唐生防菌Epicoccum sorghinum的次生代谢产物具有良好的除草活性，对多种杂草都有良好防效，具有开发为生物除草剂的潜力。（1）本研究针对E. sorghinum除草活性次生代谢产物的分离、纯化与鉴定，使用硅胶柱层析、薄层层析、高效液相色谱等方法对代谢产物进行分离纯化；使用核磁共振、质谱等方法对分离到的代谢产物进行鉴定。得到Epoxydon和(+)-gabosine Q两个化合物，其中仅Epoxydon具有明显的植物毒性，且在提取物中含量最高，是E. sorghinum最主要的除草活性次生代谢产物成分。（2）进一步通过第三代基因组测序获得了E. sorghinum基因组的精细图谱，使用antiSMASH等生物信息学方法分析预测了到了30个与次级代谢产物生物合成相关的基因簇。其中Contig13.1基因簇与棒曲霉素生物合成基因簇有较高的相似度，而Epoxydon是棒曲霉素生物合成途径的中间产物，说明Contig13.1基因簇与Epoxydon的生物合成可能密切相关。通过转录组测序分析发现，Contig13.1基因簇中的所有基因在E. sorghinum侵染寄主12h相比于对照处理表达量没有显著变化，但Contig13.1基因簇中的A01551、A01552、A01553、A01555、A01556、A01558具有相当高的表达水平，均位居表达水平的Top10。Epoxydon是E. sorghinum次生代谢产物中主要的除草活性成分可能与Contig13.1基因簇高水平表达有关。（3）为了确定Epoxydon生物合成关键基因，优化了E. sorghinum原生质体遗传转化体系；构建了Contig13.1基因簇中A01556基因的基因敲除菌株和回补菌株，相比于野生型菌株，A01556基因敲除菌株的次生代谢产物提取物中缺少了Epoxydon，而在回补菌株的次生代谢产物提取物中Epoxydon又重新出现，说明A01556基因是E. sorghinum中Epoxydon生物合成途径中的关键基因；另外，A01556基因敲除后降低了对寄主的致病能力，说明Epoxydon在E. sorghinum侵染寄主过程中发挥了重要作用。本研究为马唐生防菌E. sorghinum的进一步研究和开发利用提供了理论依据，为构建稳定遗传的Epoxydon高产工程菌株奠定理论基础。