microRNA介导三疣梭子蟹鳃渗透压调节的转录后调控机制研究

Portunus trituberculatus are weak high osmoregulators. Their internal osmotic pressure is vulnerable to external salinity change, which then indirectly affects their growth, development and immune system. Thus it has a great theoretical and practical value to clarify the mechanism of their osmoregulation. MicroRNA (miRNA) is an important non-encoding small RNA involves in post-transcriptional regulation. Based on our preliminary data, miRNA is playing essential role in osmoregulation of Portunus trituberculatus, however, the potential mechanism is unclear. In this study, we plan to understand how miRNA mediates the molecular mechanism contribute to osmoregulation in the gill of P. trituberculatus. Firstly, using multiple generation inbred lines, we will screen and identify osmoregulation-related miRNA (Or-miRNA). Then, accurate identify target genes of Or-miRNA by in vivo and in vitro methods. Thirdly, study the dynamic association model of Or-miRNA, target genes, hemolymph osmolality and ion concentration under different salinity stresses. Finally, we compared the differential expression of Or-miRNA in low salt sensitive and tolerant lines. This study will be the first to clarify the osmoregulation mechanism in crustacean from post-transcriptional level, and will provide a new way for the cultivation and identification of salt tolerant varieties.

三疣梭子蟹属海水“弱”高渗调节型蟹类，体内渗透压易受外界盐度变化的影响，从而间接影响正常的生长、发育和免疫，解析其渗透压调节机制具有重要的理论和应用价值。microRNA（miRNA）是一类能够在转录后调控中发挥重要功能的非编码小分子RNA，前期研究初步证实其在三疣梭子蟹鳃渗透压调节中具有重要作用，但潜在的机制尚不明确。本项目拟开展miRNA介导鳃渗透压调节的分子机制研究：首先，利用连续多代近交家系，在前期发掘miRNA的基础上筛选并鉴定渗透压调节相关miRNA（Or-miRNA）；其次，通过体内和体外的验证方法，准确鉴定Or-miRNA的靶基因，并系统研究Or-miRNA、靶基因和机体渗透压指标在盐度胁迫下的动态关联模式；最后，比较分析Or-miRNA在低盐敏感和耐受家系间的表达模式差异。本项目首次从转录后调控水平解析三疣梭子蟹渗透压调节机制，将为耐盐良种的培育或鉴定提供新思路。

三疣梭子蟹是我国重要的海水经济蟹类，属海水“弱”高渗调节型蟹类，体内渗透压易受外界盐度变化的影响，从而间接影响正常的生长、发育和免疫，解析其渗透压调节机制具重要的理论和应用价值。microRNA（miRNA）是一类能够在转录后调控中发挥重要功能的非编码小分子RNA。本项目从转录后调控水平解析了三疣梭子蟹鳃渗透压调节机制，系统开展了渗透压调节相关miRNA的发掘及鉴定、miRNA与靶基因的体内外验证以及miRNA在盐度适应中的作用机制等研究内容，取得的主要进展如下：1）基于高通量测序数据，共鉴定到478个miRNA，其中336个已知miRNA，142个新预测miRNA，长度分布主要集中在21—23nt的范围内。通过组间比较，获得了163个显著差异表达的miRNA并进行了qPCR验证；2）基于转录组unigene注释信息，共预测到7949个miRNA靶基因，其中包括Na+/K+-ATPase、Na+/H+-exchanger等重要离子转运或盐度适应相关基因。通过体内、外水平的分子生物学实验，共验证了4组三疣梭子蟹渗透压调节相关miRNA-靶基因，包括miR-200137-Na+/K+-ATPase、miR-466f-3p-Na+/H+-exchanger、miR-139555-PtNBC和miR-301006-Ptngo，明确了这些miRNA可以负调控其靶基因的表达；3）通过miRNA过表达等方法，结合体内离子转运酶活、渗透压和重要离子水平的关联分析，明确了miRNA可通过调控离子转运相关基因的表达，从而调节三疣梭子蟹机体渗透压和离子水平的分子机制；4）利用三疣梭子蟹不同耐盐家系材料，比较分析了离子转运相关miRNA及其靶基因在盐度胁迫后的表达模式差异，发现其在盐度敏感家系中的表达更易受外界盐度变化影响的现象。本项目从转录后水平解析了miRNA在三疣梭子蟹渗透压调节中的功能及作用机制，研究结果对于系统阐明三疣梭子蟹盐度适应机制具重要意义，同时为耐盐良种的培育或鉴定提供了重要参考。