链格孢菌中腾毒素的生物合成基因研究

腾毒素是由一些链格孢属真菌产生的环四肽毒素。腾毒素选择性抑制植物叶绿体F1-ATP酶活性而导致植物萎黄病。在前期研究中，链格孢中的一个非核糖体肽合成酶基因（即腾毒素合成酶基因）及其上游的一个细胞色素P450基因被证明参与腾毒素的生物合成，其中细胞色素P450基因的功能尚待体外表达实验证明。本课题将构建链格孢菌的基因组文库，继续克隆和测序参与腾毒素生物合成的其它基因。然后采用目的基因敲除或基因体外表达实验证明这些基因的功能，以阐明腾毒素的生物合成途径。本课题还将研究腾毒素的生物合成基因的表达调控分子机制。并通过强启动子过量表达调控因子再次验证腾毒素生物合成基因簇并提高链格孢菌中腾毒素的产量。本课题不仅从分子水平阐明链格孢菌中腾毒素的生物合成途径及其表达调控分子机制，还将实现联合使用实时荧光定量PCR和HPLC方法准确检测分析云南省的一些农作物中污染的腾毒素合成酶基因和腾毒素含量。

腾毒素是由一些链格孢属真菌产生的环四肽，主要生物活性是选择性抑制一些高等植物叶绿体F1-ATP酶活性而导致植物萎黄病，其抑制机理是低浓度下抑制叶绿体F1-ATP酶中ATP水解和合成。在微生物中，环肽不是由核糖体合成，而是由非核糖体肽合成酶（NRPS）合成。本研究首先从紫茎泽兰的病斑叶片中分离和鉴定了链格孢属真菌。研究发现4株链格孢属真菌产生腾毒素。然后根据NRPS基因的保守序列设计引物，克隆了链格孢菌Z33A的NRPS基因，测序后发现克隆的2段NRPS基因片段属于同一NRPS基因（即腾毒素合成酶基因，TES），并对其进行了全测序。TES不含内含子，全长15.5 kb，编码5163 aa。分析TES序列发现其含有4个模块和2个N-甲基化结构域，这与其催化合成腾毒素的结构相一致。同源重组敲除实验证明TES突变体不产生腾毒素而野生型菌株Z33A产生腾毒素，推断TES是腾毒素合成酶基因。.链格孢菌中腾毒素合成酶基因TES两端区域的基因组DNA序列被测序。目的基因敲除实验证明TES的上游的一个细胞色素P450基因（TES1）敲除后的突变株也不产生藤毒素，表明TES1参与藤毒素的生物合成。TES1 有5个内含子，预期编码506 aa。.研究了4株链格孢属真菌在不同的培养基中产生腾毒素及建立了HPLC检测产生的腾毒素。根据TES和TES1的基因序列分别设计专一性引物，采用实时荧光定量PCR检测分析研究了链格孢在不同培养条件下TES和TES1的基因转录表达。另外，从小葱、苹果和银杏叶中分离了病原内生真菌。检测TES分析结果表明，除了链格孢属真菌外，一些黑孢霉属（Nigrospora）、毛霉属（Mucor）和旋孢腔属（Cochliobolus）真菌也被检测到存在TES。这些有TES的菌株培养后发现只有链格孢属真菌检测到藤毒素，而其他3个属的真菌没有检测到藤毒素。通过克隆和测序不同属真菌中的基因TES和TES1，分析病原真菌中的腾毒素生物合成基因序列差异性与产腾毒素的相关性，建立PCR检测产腾毒素真菌的方法，并验证其可行性。本研究首次从链格孢菌中克隆和证明了TES和TES1参与藤毒素的生物合成，从分子水平阐明了链格孢菌中腾毒素的生物合成机制。本课题研究也有助于从分子水平上准确快速检测分析农作物污染的产腾毒素真菌，为进一步防治作物病害提供依据。