分支DNA检测肿瘤患者外周血游离DNA方法的建立及临床应用研究

Alu家族是灵长类基因组特有的含量丰富的中度重复序列，因能被限制性内切酶 Alu I识别并切割（AG↓CT）而得名，基因组全部基因的四分之三都和Alu有关。既往研究已证实血游离DNA存在于癌症转移患者和早期原发癌症患者的血清中。现有的定量检测方法多需提取血微量DNA，限制了检测的灵敏度，积极探索新的敏感、快捷、廉价检测方法显得尤为必要。本项目针对Alu基因序列设计四条捕获辅助探针和两条标记辅助探针，采用分支DNA技术检测血游离DNA含量，在此基础上对建立的新方法进行精密度、准确度、分析灵敏度、分析干扰性能的评价。同时与目前国内外常用的实时荧光定量PCR检测游离DNA的方法进行比较，并进一步检测如肺癌、卵巢癌、结直肠癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、良性肿瘤、炎症和健康对照者血标本。本研究可为血游离DNA的检测提供新的策略和思路，并为肿瘤的诊断尤其是早期诊断提供辅助依据。

游离DNA（cell free DNA，cf-DNA）是一种无细胞状态的胞外DNA，广泛存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中。本研究采用分支DNA（branched DNA，bDNA）信号放大定量技术建立检测血中cf-DNA-ALU基因表达的方法，并对构建方法的线性、检测限、精密度和正确度等进行评价同时与国内外应用较多的实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）方法进行比较；并应用于多种肿瘤疾病和急性冠脉综合症患者血cf-DNA的检测。结果表明，建立的bDNA方法在标准品浓度为0~400 ng/ml时，线性回归方程为y=1778.9x，相关系数R2=0.992；该方法最低检测限为0.86 ng/ml；批内和批间变异系数分别在7.53%~13.04%和8.05%~13.28%的范围内，回收率在93.35%~115.76%之间。与RTFQ-PCR相比，该方法一个测试仅需要10 µl血清，无需进行血中微弱cf-DNA的提取。对145例实体肿瘤、230例血液肿瘤和137例急性冠状动脉综合症患者cf-DNA含量的检测发现，疾病患者cf-DNA的含量均显著高于其对照组；cf-DNA含量的增高与疾病严重程度有关。cf-DNA可能是多种疾病辅助诊断的一个灵敏而非特异的生物学指标。. DNA完整性一般用DNA长、短片段扩增产物的含量比值表示。我们通过RTFQ-PCR方法对70例胶质瘤患者外周血、20例胶质瘤患者和8例非肿瘤对照（脑积水或蛛网膜囊肿患者）的脑脊液标本中cf-DNA含量（ALU115、ALU247）进行检测。结果表明，胶质瘤患者血清cf-DNA含量与对照组相比无显著差异，而胶质瘤患者脑脊液cf-DNA含量却显著高于对照组；检测胶质瘤患者血清及脑脊液cf-DNA完整性发现，脑脊液非血清中cf-DNA完整性显著高于正常对照组。. 本研究所建立的bDNA方法具有特异、重复性好、操作简便、取材易被患者接受等特点。cf-DNA含量及完整性检测尤其适用于多种肿瘤和心脏疾病等高危人群的辅助诊断和病情监测。