L-阿拉伯糖异构酶的热稳定性与弱酸稳定性的分子机制

L-阿拉伯糖异构酶（L-AI）有望成为继葡萄糖异构酶之后第二个工业化应用的醛酮糖异构酶。热稳定性及弱酸稳定性机制是目前L-AI基础研究的两个热点问题，耐热及耐弱酸亦是L-AI实现工业化应用的必备条件。本项目利用分子生物学技术，克隆、表达和纯化L-AI；结合DSC和CD等技术，研究L-AI的热稳定性与酶空间结构之间的关系；研究金属离子在L-AI结构中的结合模型，揭示金属离子在稳定L-AI空间构象，提高L-AI热稳定性的机理；通过随机突变与定点突变等技术研究L-AI结构与功能之间的关系，验证特定氨基酸对于L-AI热稳定性及弱酸稳定性的贡献，研究L-AI特定结构域在发挥酶活中的结构与功能变化关系；利用蛋白质工程原理及技术进行L-AI的分子改造，以获得热稳定性和弱酸稳定性符合D-塔格糖工业化生产要求的突变酶。该项目的开展对于L-AI的结构与功能关系的阐明及L-AI工业化应用提供必要的理论基础。

本项目利用分子生物学而技术，探索了L-AI热稳定性与弱酸稳定性的分子机制，研究结果概括如下：（1）通过分子克隆、表达纯化和性质鉴定，研究了来源于Acidothermus cellulolytics ATCC 43068和Bacillus stearothermophilus IAM11001等微生物L-AI的酶学性质与动力学参数；（2）A. cellulolytics L-AI最适pH与最适温度分别是75 oC和pH 7.5，具有良好的热稳定性和较宽的pH范围，65 oC以下保持相对稳定，在pH 6.0-8.0之间都表现出90%以上活性；Mn2+和/或Co2+对该酶的活性和热稳定性都有明显的促进作用，而Cu2+和Hg2+ 则对酶产生了明显的抑制作用；（3）A. cellulolytics L-AI对L-阿拉伯糖表现出最高的底物特异性，其次为D-半乳糖；其催化L-阿拉伯糖的动力学参数Km、Vmax及催化效率kcat/Km分别为15.2 mM、6.8 U/mg和24.6 min-1 mM-1，催化D-半乳糖的Km、Vmax和kcat/Km分别为28.9 mM，4.9 U/mg和9.3 min-1 mM-1；（4）通过结构分析和理性设计及定点突变研究，表明A. cellulolytics L-AI的L20对于其底物专一性具有重要贡献，突变体酶L20A对D-半乳糖的底物亲和性显著提高，为野生型酶酶活的2.2倍，催化效率由9.3 min-1 mM-1提高到13.6 min-1 mM-1；同时验证Y21、Y336、N123和N125位氨基酸残基参与了其开环催化关键过程；（5）B. stearothermophilus IAM11001 L-AI中，G110对于其弱酸稳定性具有一定贡献，推测由于该位上残基电荷性质的不同，影响活性中心微电荷环境，从而使该L-AI可以在酸性条件下保持高活性。该项目的开展对于L-AI的结构与功能关系的阐明及L-AI工业化应用提供必要的理论基础。在本基金项目资助下，已发表SCI论文13篇，获得授权发明专利2项，申请国家发明专利14项，荣获教育部科技进步二等奖等科研奖励4项。