Fasciclin-1结构蛋白在红色毛癣菌生长发育和侵袭宿主细胞中的作用机制研究

Trichophyton rubrum is the most common dermatophytes which causes superficial fungal diseases globally with an extremely high prevalence and recurrence, while the molecular mechanism of its interaction to host remains not very clear. Fasiclin1-1 domain protein (FAS1) is a membrane-associated glycoprotein reported in human，animals, plants, insects, bacteria and plant pathogenic fungi, involved in the biological development, cell wall biogenesis, signal transduction and cell adhesion. There is no report of FAS-1 domain protein in clinical fungi up to now. In our previous study of the comparative analysis of dermatophytes genome, a FAS1 protein was predicted as the adhesin of T. rubrum. The accurate gene coding sequence was obtained by Sanger technique and this gene showed a higher expression in T. rubrum after keratin interaction by reverse transcription-PCR and Real-time PCR analysis. In this study, we will construct a FAS1-domain mutant model in T. rubrum and co-culture it with keratinocyte and macrophage, respectively, to study the effects of FAS1 domain proteins on the T. rubrum development, cell wall integrity, adhesion to keatinocytes, reaction with maccrophage and the profiles of immue reaction. On the basis of above study, we aim to illuminate the molecular pathogenecity of dermatophytes, to provide new insight into the prevention and treatment of dermatophytosis.

红色毛癣菌为最常见的皮肤癣菌，所致癣病全球高发流行，复发率高，该菌与宿主细胞作用的分子机制尚不清楚。Fasciclin-1结构蛋白（FAS1）存在于人类、动物、植物、昆虫、细菌和植物致病真菌，为一类参与生长发育和胞壁合成，介导信号转导和细胞间粘附的膜相关糖蛋白，在临床致病真菌中尚无报道。我们在前期皮肤癣菌比较基因组分析中，预测到一个FAS1样蛋白为红色毛癣菌粘附因子，Sanger测序获得精确片段，RT-PCR和Real-time PCR分析示富含角质培养基中，该基因表达增高。本项目拟建立红色毛癣菌FAS1样基因突变模型，并分别与角质细胞和巨噬细胞共培养，通过与野生型比较，研究FAS1样蛋白对红色毛癣菌生长发育和细胞壁完整性的影响，以及介导菌株与角质细胞粘附、激活巨噬细胞抗原提呈，启动机体免疫反应的分子机制。由此进一步阐明皮肤癣菌的病原分子机制，为癣病防治提供新思路。

红色毛癣菌为最常见的皮肤癣菌，但其与宿主细胞作用的分子机制尚不清楚，原因有两方面：早期缺乏该菌的分子信息尤其是组学信息，其专性亲嗜人性导致缺乏动物模型。我们前期工作中，对红色毛癣菌全基因组序列进行分析，预测到它三个重要致病性蛋白酶家族中的22个基因和一个可能与其粘附功能相关的FAS1样蛋白。本项目围绕这些重要的致病因子展开：（1）利用CRISP-Cas9技术构建红色毛癣菌营养缺陷型的基因模型（URA3-）；（2）构建FAS1-URA+的红色毛癣菌菌株，并进行形态学和功能验证；（3）基因组水平预测皮肤癣菌蛋白酶分子并进行系统进化分析；（4）1%角质和1%人甲屑刺激下，红色毛癣菌分泌性蛋白酶的表达情况。 .所获得的主要数据和结论有：（1）成功建立红毛营养缺陷型基因模型，成为开展癣菌分子功能研究的基础；（2）构建FAS1基因删除模型，在形态学和选择性培养基上显示成功，但是分子验证失败，目前还在寻找原因；（3）皮肤癣菌分泌性蛋白酶M35、M36，S9A家族各自有5个、5个和12个家族成员，DNA序列具有高度保守性，每个菌株具有同样的拷贝数；但是不同宿主性菌种呈现不同的进化速率，其进化与其致病性和宿主偏好相关；（3）角质和人甲屑能够刺激癣菌蛋白酶的表达，角质对红色毛癣菌的刺激更大，不同癣菌中mRNA水平存在明显多态性。如M35家族的五个分子（NPⅡa-e），在红色毛癣菌和紫色毛癣菌中DNA水平高度同源，但是mRNA表达水平差异巨大；在角质刺激下，NPⅡb, NPⅡc, NPⅡd 和 NPⅡe 在紫色毛癣菌中表达明显高于前者；蛋白酶分子表达呈时间依赖性，大部分分子在48h最高，96h后下降。.该序列研究的科学意义：构建了具有筛选标记的红色毛癣菌基因删除模式菌株；在基因组和mRNA水平了解了皮肤癣菌的分泌性蛋白酶的分布和表达情况，并发现了一些值得进一步研究的分子。.