金黄色葡萄球菌多药外排蛋白QacA的功能分析和优化表达研究

用完全半胱胺酸替换扫描诱变（complete cysteine-substituted scanning mutagenesis）的方法，突变耐消毒剂灭菌剂的金黄色葡萄球主动外排蛋白QacAα-螺旋及其环上的所有氨基酸，然后以体外药物敏感性试验，主动运输试验全面分析影响外排功能的重要氨基酸，以巯基特异性试剂4-acetamido-4'-maleimidylstilbene-2,2'-disulfonic acid（AMS）和N-己基顺丁烯二酰亚胺(NEM)对每一氨基酸定位，验证计算机模拟的该蛋白二级结构；同时构建QacA蛋白的表达质粒，优化表达条件，大量表达纯化该蛋白，为下一步的结晶奠定基础。本实验对多重耐药金黄色葡萄球菌外排蛋白耐多药机理分子水平的研究是对以往研究工作的扩展和深入，将进一步推动国内对生物膜蛋白的研究，为开发外排蛋白抑制剂提供靶位

本研究用半胱胺酸替换诱变的方法，突变金黄色葡萄球主动外排蛋白QacAα-螺旋及其环上的氨基酸，然后以体外药物敏感性试验，运输试验分析影响外排功能的重要氨基酸，同时人工合成优化密码子的qacA构建QacA蛋白的表达质粒，优化表达条件，高效表达该蛋白。对携带qacA基因在MRSA和MSSA的分子流行病学研究表明对消毒剂耐药的菌株有更多的可能性导致对各类抗菌药物的耐药，并发现存在3种不同型别的克隆携带有消毒剂基因的MRSA的在医院内流行。试验结果表明位于金黄色葡萄球菌 α- 螺旋上的氨基酸S3,F4,F5,T6,R17,T19,A20,F29,E50,P51,F159,P160,L167,L168,F177,P182,F183，L194，K199，K202，E203，D209，P211…等在一价和二价底物的转运中可能具有重要作用，发现这诱变株与野生株相比的 MIC 值降低明显，且转运能力也下降 ：大多数跨膜运输蛋白的带电荷氨基酸都位于跨膜区域内，这是因为如果位于疏水的膜内则需要很高的能量，相邻的带相反电荷的残基配对形成盐桥可稳定 α-螺旋的跨膜结构，这些氨基酸可能直接参与底物转运。谷氨酸和精氨酸都是带负电荷的氨基酸，结构上只是羧基基团上的微小差别， 但二者在功能上是不能互换的。芳香族氨基酸的苯环提供负性静电区能较牢固的结合阳离子底物，又称为阳离子-π相互作用；许多多药转运蛋白位于膜内的芳香族氨基酸对于转运和/或结合亲脂性阳离子是必须的，而酪氨酸可通过中和天冬氨酸的负电荷来稳定底物结合区域。本实验所选用的pET-coco1载体为带有T7lac启动子的原核表达载体，并选择了适用于高效表达的受体菌大肠杆菌BL21(DE3)，它可使表达系统处于稳定并使外源基因在T7RNA聚合酶天然启动子控制下获得高效表达等优点。试验结果表明重组质粒pET-coco1/qacA转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导成功地表达了QacA蛋白，其分子量约为55千道尔顿；优化后重组载体pET-coco1/qacA在大肠杆菌中得到高效表达；Western Blotting试验显示QacA表达蛋白与合成的兔抗呈特异性免疫反应。优化后的qacA重组蛋白在大肠杆菌中表达量高于未优化的qacA重组蛋白。完成4篇相关文章，已发表2篇，培养硕士研究生4名。准备报2013年细菌耐药相关工作的成果。