LPA-LPAR1信号通路介导糖尿病肾病肾小球系膜细胞增殖的作用及其分子机制

To find and study the therapeutic targets of different signaling pathways in the pathogenesis of diabetic nephropathy, and to design new therapeutic drugs is an important direction for the treatment and prevention of the disease. The paper was published in the Journal “Kidney international”, shows the role of the LPA-LPAR1 pathway in the development of diabetic nephropathy. Our preliminary results of this study are as follows: (1) In db/db mice, LPA-LPAR1 signaling promotes mesangial cell growth and synthesis of mesangial matrix in diabetic nephropathy. (2) In vitro experiments showed that LPA induces mesangial cell hyper-proliferation. On this basis, this study intends to establish mouse model of db/db, multi-level (overall, animal model, cell and molecule) and methods (molecular biology, flow cytometry etc.) combined method, intends to investigate LPA-LPAR1 induced cell proliferation related transcription factor and to observe changes of related cell cycle proteins or cells cycle inhibitor protein. We will investigate molecular biology mechanism of LPA induced mesangial cell proliferation, intends to further clarify role of the LPAR1 pathway in the development of diabetic nephropathy, not only reveals the target can inhibit mesangial cell abnormal changes, provide a new direction for clinical treatment and prevention.

发现并研究糖尿病肾病发生的不同信号通路的治疗靶点，设计新治疗药物是治疗及预防此病的重要发展方向。申请人发表的“Kidney international”论文中，证明LPA-LPAR1通路在糖尿病肾病发生发展中的促进作用。项目前期研究结果表明，在动物模型（db/db），LPA通过LPAR1信号通路促进糖尿病肾病肾小球系膜细胞生长并合成系膜基质，进而发展为纤维化。体外实验证明，LPA诱导肾小球系膜细胞过度增殖。在此基础上，本课题拟建立db/db小鼠模型，采用多层次（动物模型、细胞、分子）和多方法（分子生物学，流式细胞学等）相结合的方法，拟寻找LPA-LPAR1信号通路调控细胞增殖相关的转录因子并发现相关的细胞周期蛋白或细胞周期抑制蛋白的变化。我们将通过发现LPA促进肾小球系膜细胞增殖的分子机制， 深刻揭示抑制肾小球系膜细胞不正常变化的靶点，对临床治疗及预防提供新方向。

肾小球系膜细胞的过度增殖是进一步导致肾小球硬化以及进展到糖尿病肾病的重要发病机制之一。前期工作中，我们已利用糖尿病肾病模型db/db模型证明了抑制溶血磷脂酸（LPA）信号通路可能延缓进展到糖尿病肾病。具有研究表明LPA可诱导肾小球系膜细胞增殖，但至今相关分子生物学机制尚不明确。在本次研究的第一部分，我们通过Western blot, q-RT PCR,siRNA 等实验证明了在肾小球系膜细胞（SV40 MES13），LPA可以通过调节KLF5基因抑制细胞周期抑制因子P27基因和蛋白质的表达。而且，通过Western blot, q-RT PCR,siRNA 等实验，证明了LPA可以通过MAPK信号通路增加Egr1基因和蛋白质表达，通过CCK-8实验，证明了LPA可以通过KLF5的表达促进系膜细胞的过度的细胞增殖现象。另外，在研究的第二部分，我们通过Western blot, q-RT PCR, ELISA, 等实验得知在肾小球系膜细胞（SV40 MES13 cell）、肾小管上皮细胞(HK-2 cell)，LPA 可以通过炎症小体（inflammasome）信号通路促进细胞纤维化。通过ELISA实验，证明了LPA可以促进SV40 MES13 、HK-2细胞生成各种炎症因子（IL1β、IL18）等。采用Western blot实验，检测到在肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞，LPA促进NLRP3炎症小体（NLRP3、Caspase-1）等分子的表达生成。采用、q-RT PCR、western blot等实验方法，在肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞，处理LPA和LPAR1拮抗剂（ASP6432）时，对于NLRP3炎症小体（NLRP3、Caspase-1）生成的作用变化。总之，通过本次研究，我们已利用肾小球系膜细胞（SV40 MES13）观察到了处理LPA后可诱导细胞的过度增殖。并且证明了LPA可促进CDK4、CyclinD1细胞周期分子的表达，起作用可能是通过KLF5-P27，而LPA可以通过MAPK/Egr1信号通路，促进KLF5基因的转录，并促进过度的细胞增值进一步进展为糖尿病肾病。另外，在第二部，在肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞，LPA通过LPAR1信号通路增加及激活inflammasome信号通路，并促进细胞纤维化变化。