锌指蛋白ZFP261在精子发生中的功能研究

有效的雄性不育治疗和避孕措施的开发要求对精子发生的过程有深入了解。特异基因表达调控以及它们之间的相互作用是这一过程的分子生物学基础。近年报道锌指蛋白在精子发生过程中起十分重要的作用。申请者在前期的实验中初步研究了锌指蛋白ZFP261，利用Real-time PCR、免疫组化实验检查了它在小鼠精原干细胞中高表达，利用酵母双杂交技术找出了四个与ZFP261相互作用的转录因子Taf12、Tbp1、pcbp1、pias4。本申请将利用生物信息学、细胞生物学及分子生物学相结合的实验手段对ZFP261做进一步的功能研究，找出与它们相互作用的蛋白质，研究它们结构与功能的关系，通过ChIP-on-chip 实验寻找受ZFP261影响的具体基因，进行分类。并利用RNA干扰和基因敲除手段阐明ZFP261在精子发生中的作用。

哺乳动物通过精原干细胞（SSCs）的增殖和分化维持精子发生，文献报道显示GDNF（Glial cell-Derived Neurotropic Factor）是维持SSCs增殖的必需因子。通过芯片数据挖掘分析，我们发现一个名为Zfp261的锌指蛋白受GDNF下调。ZFP261包含在一类转录复合体中，该复合体中的成员LSD1和HDAC1/2与组蛋白的修饰有关，在胚胎发育和ESC的分化过程中行使功能，但ZFP261功能尚未见报道。我们发现ZFP261在ESC和体外培养的SSC中都有表达，并且在未分化精原细胞中高表达。利用慢病毒介导的shRNA干扰技术将SSC与ESC中的ZFP261干扰后，与对照组相比，细胞的增殖速度明显变慢。qPCR结果显示ZFP261的干扰影响了ESC中多能性marker基因的表达。小鼠SSC的睾丸移植实验表明，干扰ZFP261后的SSC不能在精小管形成正常的克隆，类似于Aal精原细胞的链条状细胞。利用RA诱导SSC分化后，定量PCR检测结果表明ZFP261的干扰在抑制了RA对Stra8基因的上调，提示ZFP261的干扰阻滞了SSC以及未分化精原细胞向下游的分化。利用酵母双杂交，我们发现了一组与之相互作用的蛋白质因子如TAF12、TBP1、PIAS4、PCBP1等。我们正在利用CRISPR-Cas9技术在小鼠中敲除ZFP261，后期会从表型、基因表达变化、DNA和组蛋白甲基化等方面进行研究。另外将使用ChIP-Seq鉴定ZFP261的直接靶基因。这些工作将揭示ZFP261在小鼠精子发生过程和ESC分化中的功能。