二化螟盘绒茧蜂被动防御关键因子的鉴定及其作用机理

In this proposal, we will focus on the mechanisms of parasitoid manipulating host immune responses and use Cotesia chilonis (Hymenoptera: Braconidae) as research model, which is an obligate larval endoparasitoid that effectively regulates the density of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae), one of the economically most important rice pests. Based on our previous study in which “passive strategy” played an important role in successful parasitism of C. chilonis, systematic analysis will be conducted to identify ovarian fluids and egg surface proteins, reveal key factors involoved in passive avoidance, show its/their expression profiles, evidence its/their biological functions and mechnisms, using approaches like transcriptomics, proteomics, RNA interference, physiological assays, Co-Immunoprecipitation and pull-down. Finally, expected results will determine the mechanisms by which C. chilonis evades host immune responses passively, supply much theoretical basis and technical platform supporting to the researches on the molecular mechanisms of parasitoids regulating host physiology and its application in the biological control of insect pests.

本项目拟围绕寄生蜂调控寄主免疫反应机制之科学问题，以水稻重要害虫二化螟幼虫期的优势内寄生蜂二化螟盘绒茧蜂为研究对象，在前期已经明确被动防御在该蜂成功寄生中发挥重要作用的基础上，拟采用转录组学、蛋白组学、RNA干扰、原核/真核表达、生理学、免疫共沉淀和pull down等方法手段相结合，分析该蜂卵巢分泌蛋白和卵壳表面蛋白组分，系统地鉴定其中的被动防御因子，明确其转录表达模式，验证其被动防御功能，解析其作用机制。最终，揭示二化螟盘绒茧蜂的被动防御机制，为进一步探索寄生蜂调控寄主生理活动的分子机理、及其在害虫生物防治中的广泛应用提供理论支持和技术保障。

寄生蜂是重要的生防资源。为保证在寄主体内成功发育，寄生蜂采用主动免疫和被动防御的机制，调控寄主免疫。相较于主动抑制寄主免疫，寄生蜂的被动防御机制研究匮乏。前期研究表明，被动防御在二化螟优势内寄生蜂二化螟盘绒茧蜂的寄生过程中，发挥重要作用。本项目采用转录组学和蛋白组学的方法，系统分析了该蜂卵巢分泌蛋白和卵壳表面蛋白的组分，鉴定到了6种已知的被动防御相关蛋白。我们对其中一种被动防御蛋白Crp32B进行了相关分析。qPCR和RNA-FISH分析表明，Crp32B基因的转录发生在卵巢细胞、滤泡细胞、滋养细胞和卵母细胞中；Western Blot和免疫组化分析表明该蛋白存在于成熟卵的表面；原核表达结合生理学实验表明，Crp32B可以有效地保护蜂卵不被寄主血细胞包囊；免疫沉淀、Pull-down和质谱分析表明，Crp32B与寄主微管蛋白具有相似的免疫原性，其可能通过分子拟态的机制行使相关功能。同时，我们对卵壳表面含量极其丰富的一种含serpin结构域的崭新蛋白CcES-SPNDP也进行了相关研究。序列分析表明，CcES-SPNDP中serpin结构域决定底物特异性的P1位点氨基酸（组氨酸）不同于其他昆虫；进化分析表明，CcES-SPNDP与二化螟盘绒茧蜂的毒液serpin和蝶蛹金小蜂毒液高表达serpin-PpS1V属于同一支系；qPCR分析表明CcES-SPNDP在含有卵泡细胞的卵母细胞中转录水平显著高于其他雌蜂组织；Western Blot和免疫组化分析表明该蛋白分布于卵母细胞以及成熟卵的表面；功能分析发现，CcES-SPNDP可以显著抑制寄主血淋巴的黑化反应。最终，本项目明确了二化螟盘绒茧蜂卵壳表面蛋白Crp32B的被动防御作用，提供了其通过分子拟态机制行使功能的重要证据。同时，卵壳表面蛋白CcES-SPNDP可以主动抑制寄主血淋巴的黑化反应，表明二化螟盘绒茧蜂卵壳表面蛋白通过主动和被动相结合的方式，调控寄主免疫。本项目的研究结果有助于加深我们对寄生蜂调控寄主免疫机制的理解，并为开发新型害虫免疫抑制剂用于生物防治提供支持。