棉花草甘膦抗性基因的克隆及功能验证

The transgenic glyphosate-resistant crop has the largest acreage in commercialized transgenic crops around the world, but we have not successfully developed glyphosate-resistant crops with our own independent intellectual property rights to market. A native mutant cotton, named TRC98-33, with high glyphosate-resistant was found by our unit in previous research. It was shown that, by the genetic studies, the trait of glyphosate resistance of TRC98-33 was controlled by a pair of dominant gene, without the effect of cytoplasm. Based on the glyphosate resistance identification on a physiological level and exclusion of its resistance obtained on the basis of known glyphosate resistance gene contamination of this mutant cotton, through cloning and analysis of genomic chimeric number and tissue-specific expression of glyphosate target enzyme EPSPS, using gene functional complementation of prokaryotic expression system and gene overexpression of plant expression system as research means, to fully resolve the glyphosate resistance mechanism of EPSPS gene in mutant cotton. Obtaining clear value of Km[PEP] and Ki[glyphosate] of EPSPS enzyme by enzymatic kinetics research, to provide a theoretical basis for the practical application of this gene in agricultural production. The research achievement of this project may provide candidate gene that be based on cotton EPSPS for creating transgenic glyphosate-resistant crops with china-only independent intellectual property rights.

转基因抗草甘膦作物是全世界商业化种植面积最大的转基因作物，而我国到现在还没有自主知识产权的抗草甘膦作物面市。在前期的研究中，我单位发现了一株高抗草甘膦的棉花自然突变体TRC98-33，该突变体的草甘膦抗性由一对显性基因控制，且无细胞质效应。在对该突变棉株生理水平草甘膦抗性鉴定以及排除其抗性的获得是已知草甘膦抗性基因污染的基础上，本项目通过对该突变体草甘膦靶标酶EPSPS基因的克隆、基因组嵌合数目及组织特异性表达的分析，运用原核表达系统的基因功能互补和植物表达系统的基因超表达等研究方法，来深入解析该突变体对草甘膦的抗性机理；并通过研究该EPSPS酶的酶促动力学，获得明确的Km[PEP]和Ki[草甘膦]值，为该基因的农业实践应用提供理论依据。本项目的研究成果将可能为我国抗草甘膦转基因作物的创制提供以棉花EPSPS基因为基础的具有自主知识产权的候选基因。

全世界商业化转基因作物最主要的性状之一是对除草剂草甘膦的抗性，我国一部分科研工作者一直在致力于草甘膦抗性转基因作物的研究。本项目以我单位发现的一株高抗草甘膦的棉花自然突变株苏9833（原名TRC98-33）为研究对象，成功克隆了具有草甘膦抗性的草甘膦靶标酶EPSPS基因；克隆获得的EPSPS1’基因同正常的EPSPS1基因在核苷酸序列上有3处点突变；构建的原核表达载体在转化后的大肠杆菌表现出对草甘膦很高的抗性；构建了EPSPS1’基因超表达植物表达载体，转化水稻获得的转基因水稻表现出对草甘膦有一定的抗性。该研究结果将为我国抗草甘膦转基因作物的创制提供以棉花EPSPS基因为基础的具有自主知识产权的候选基因。. 随着陆地棉基因组测序结果的公布，为在陆地棉中基因组全面鉴定EPSPS基因的存在提供了便利条件。本研究从陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据库中共搜寻获得4个EPSPS同源基因，这4个基因分别分布在A07、A12、D07和D12亚基因组。从这4个基因的核苷酸序列、氨基酸序列和基因结构的比对，构建进化树的系统发育分析以及基因的转录情况研究来看，定位在A07和D07亚基因组的两个基因属于共线性高度同源基因，定位在A12和D12亚基因组的两个基因也是相同的情况。本研究结果为全面而深入的研究陆地棉EPSPS提供了理论基础。. 在研究过程中克隆获得了一个EPSPS基因的可变剪接体，该剪接体（EPSPS1-1）的CDS比EPSPS1少282 bp；EPSPS1-1剪接体的可变剪接采用的是外显子跳跃式和5’位点选择式这两种剪接方式；其转录产物内含子序列识别位点有一个识别位点符合AU（T）-AC规则；构建了该剪接体的原核表达载体，并在大肠杆菌中成功诱导表达，通过在M9基本培养基中的生长研究发现该可变剪接序列不具备正常EPSPS基因所具有的功能。该研究结果丰富了棉花EPSPS基因转录本存在的形式，为深入研究棉花EPSPS基因的转录机制打下了基础。