胸腺素β4上调长链非编码RNA-MALAT1促进缺血心肌血管新生的分子机制研究

Thymosin beta 4 (Tβ4) is a pleiotropic peptide and participates in promotion angiogenesis, which is expected to become a fundamental tool for the treatment of ischemic heart disease and attracted many attentions, but its Molecular mechanism is far to confirm. Though the RNA sequence earlier, for the first time, we found the function of Tβ4 on the microvascular endothelial cells to promote Long chain non-coding RNA-MALAT1, which proved MALAT1 is a vital molecule for angiogenesis promotion. So, how Tβ4 regulates MALAT1? And what is the molecular mechanism of the MALAT1 to promote angiogenesis? Both are the typical problems to be solved in this research. Through preview researches and analysis of RNA sequences, these questions will be to verify with the following hypothesis: Tβ4 inhibits the ubiquitin degradation of the transcription factor c - Myc by ILK/AKT/GSK - 3 beta which results in raising the MALAT1 expression. Ultimately, MALAT1 promotes angiogenesis and proliferation of vascular endothelial cells, through a competitive combination with miR-503. Numbers of molecular biological techniques will be used to prove the molecular mechanism that Tβ4/MALAT1/miR503 promotes angiogenesis in this study. This study will demonstrate the importance of Long chain non-coding RNA in the mechanism of Tβ4 for the first time, which provide foundations for widespread use of Tβ4, and new ways or target for the angiogenesis promotion.

胸腺素β4 (Tβ4)因其促血管新生作用,成为治疗缺血性心脏病的有效候选药物，但其促血管新生的具体分子机制远未阐明。前期我们通过转录物组测序，首次发现Tβ4作用于微血管内皮细胞后显著上调长链非编码RNA-MALAT1，并证明MALAT1是Tβ4促血管生成的重要分子。那么Tβ4如何上调MALAT1？MALAT1又如何促进血管新生？是本课题的关键科学问题。通过序列分析和文献复习，我们提出“Tβ4通过ILK/AKT/GSK-3β途径抑制转录因子c-Myc泛素化降解,进而上调MALAT1;MALAT1又通过竞争性抑制miR503的功能，发挥促血管生成作用”假说。本课题将通过多种分子生物学手段，探讨Tβ4/MALAT1/miR503促进血管新生的分子机制并证实上述假说。本课题首次证明长链非编码RNA在Tβ4作用机制中的重要作用，将为Tβ4的广泛应用奠定理论基础，也为治疗性血管新生提供新思路和新靶点。

心肌梗死(MI)是指冠状动脉因血栓而出现血流急剧减少或中断，使相应的心肌发生缺血性坏死的心脏疾病。胸腺素β4（Tβ4）是胸腺素组分中的一种43个氨基酸的多肽，在胚胎冠脉发育过程中至关重要。因其具有诱导血管新生，抑制心肌纤维化等特点被认为是可能从根本上治疗MI的有效药物。前期，本课题组根据文献报道和以往经验设计并生产了重组Tβ4二聚体（DTβ4）。该二聚体含有两个完整的Tβ4单体，分子量达到9500 Da，基因工程生产工艺简单，一步纯化率达到98%。该产品及生产工艺获得两项国家发明专利，它的促创伤愈合研究获得国家科技重大专项的资助（2011ZXJ091104-01B），目前已经完成临床前研究，即将申报临床批件。.鉴于野生型Tβ4在心肌梗死治疗中的重要作用，本课题拟在前期研究基础上开发DTβ4对发生心梗的心脏的保护应用，并且对其心脏保护功能的分子机制进行探索。为完成上述研究目的，我们进行了以下科学工作：.1. 细胞划痕、小管形成、Transwell实验、流式细胞术等方法对比DTβ4与Tβ4在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）、SD大鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞中的生物学活性。.2. 结扎小鼠冠状动脉左前降支建立心肌梗死动物模型，DTβ4或Tβ4治疗后对比DTβ4与野生型Tβ4对心梗后小鼠心脏的保护作用。.3. 转录组测序（RNA-seq）分析DTβ4相对野生型Tβ4促血管生成活性提高的分子机制，通过实时定量PCR、RNA干扰、BrdU增殖实验等方法对测序结果进行验证。.4. 转录因子芯片、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀探索DTβ4通过肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1），促进血管新生的分子机制。.因此，我们得出了如下结论：.DTβ4相比野生型Tβ4具有更强的促血管生成作用，对心肌梗死小鼠表现出更强的心脏保护功能；DTβ4通过上调MALAT-1促进血管内皮细胞的增殖进而促进血管生成，而Tβ4不上调MALAT-1，仅仅具有促血管内皮细胞迁移的作用，不具有促进血管内皮细胞增殖的功能；MALAT-1的表达被干扰后，DTβ4促血管生成的功能与Tβ4相当，并且促增殖作用消失；DTβ4通过抑制转录因子PROX1的泛素化降解从而上调MALAT1的转录，发挥促血管生成作用。.本课题系统研究了DTβ4在心肌梗死中的保护作用及分子机制，为进一步开发DTβ4保护心脏的应用和开发奠定了基础。