基于选择信号的UGT2B4上游增强子区功能与机理研究

Natural selection signal has been suggested to be a novel approach to identify potential functional region in human genome. UGT2B4 is an important metabolism enzyme in human body and has been proposed to correlate with breast cancer. In the upstream region of its coding gene, a strong balancing selection has been observed but the real function region and its mechanism is still not clear. In the present study, we will utilize 1000 genomes plan data in corresponding region to perform selection analysis and choose the regions with the strongest signal as potential function ones. By using luciferase assay, we will compare the enhancer activity of the two haplotypes in each region to determine the enhancer location. Moreover, we will perform chromosome conformation capture experiment to figure out the target gene of this enhancer. To scrutinize the functional mutation in the enhancer, we will utilize mutagenesis approach to generate multiple plasmids with only one nucleotide difference and compare their enhancer activity. Furthermore, we will use bioinformatics method, chromatin immunoprecipitation, and RNA interference to identify the transcript factor that can bind to this enhancer. This project will shed more light on the expression regulation mechanism of the enhancer in UGT2B4 upstream region, the onset of breast cancer, and the phenotype difference for balancing selection. Meanwhile, it will provide an ideal example for how to utilize multiple approaches to identify functional region in human genome.

自然选择信号被视为寻找人类基因组潜在功能区域的一种新手段。UGT2B4是人体内一个重要的代谢酶并被认为与乳腺癌相关，在其编码基因上游发现了强烈的平衡选择信号，然而其具体功能区域及机理仍不清楚。本项目拟通过对千人基因组计划数据进行选择信号分析，挑选信号最强区域为潜在功能区域。利用荧光素酶体系比较每一区域两个不同单倍型的报告基因表达，以确定增强子位置。进而采用染色体构象捕获技术，确定该增强子的目的基因。对于该增强子区域的多个位点，采用人工突变方法逐一敲除以构建多个衍生质粒，并对其增强子活性差异进行比较以确定功能性位点。此外，采用生物信息学预测结合染色质免疫沉淀及RNA干扰技术，探讨该突变具有功能的分子机制。本项目对于研究UGT2B4基因上游区域增强子的调控机制、乳腺癌发病的分子机制及平衡选择的表型基础具有重要的意义。同时可为综合利用多种手段，搜索基因组功能区域提供一个良好范例。

自然选择信号被视为寻找人类基因组潜在功能区域的一种新手段。UGT2B4 是人体内一个重要的代谢酶并被认为与乳腺癌相关，在其编码基因上游共70kb的区域内发现了强烈的平衡选择信号，然而其具体功能区域及机理仍不清楚。通过对相应区域千人基因组计划数据分析发现，人类群体在该区域共存在663个突变，其中416个位于这两个强连锁单倍型上。其中70389001-70392000(相对于人类基因组build37) 3kb的区间内，表现出极高的Tajima’D和核苷酸多样度，暗示该区间是潜在的功能区域。随后的分段克隆、转染与荧光素酶表达实验证实，片段70390572-70391811单倍型2的增强子活力仅为单倍型1的~63.1%(P<10e-6)，表明该片段为功能性区域。对于该片段上的12个突变，通过人工突变方法逐一敲除以构建多个衍生质粒，并对其增强子活性差异进行比较，结果表明两个突变rs66862535和rs68096061，可分别降低其单倍型增强子活力至起始质粒的~40.3%(P<0.001)和~49.8%(P<0.01)水平，从而证实这两个突变是功能性位点。此外，采用生物信息学预测结合染色质免疫沉淀技术，我们发现这两个突变通过改变转录因子POU2F1结合影响增强子活力。本项目对于研究UGT2B4基因上游区域增强子的调控机制、乳腺癌发病的分子机制及平衡选择的表型基础具有重要的意义。同时为综合利用多种手段，搜索基因组功能区域提供了良好范例。此外，本项目对其他UGT2B家族成员的表达调控也进行了研究。