3D打印构筑导电纳米碳人工神经导管修复神经缺损的研究

This research is based on profound understanding of preliminary studies on 3-D structure of Sciatic nerve, use sciatic nerve in rabbits as an “Template”, use high-resolution Micro-CT、 Mimics 17.0 3-D reconstruction software and Digital printing technologies、the conductive nano carbon and type I collagen as materials to imitate 3-D anatomical morphology and extracellular matrix structure of the sciatic nerve, and build a Biotic digital tissue engineering neural tube bracket with 3-D nano micro structure. To observe its influence on attachment、growth and proliferation of Schwann cells, simulate the conductive function of myelin sheath, its role on stimulation and regeneration of nerve and axonal growth. Implant this new type of conductive carbon nano artificial nerve conduit bracket into the sciatic nerve defect model of rabbit, take autogenous nerve transplantation, biological membrane nerve conduit, acellular allogenic nerve catheter as control group, By visual observation,Electrophysiological technique,Histological staining,Scanning electron microscopy technology compare the effect of regeneration and repair of different neural conduit materials on peripheral nerve defects, continuously optimizing their performance in order to achieve the same or similar effect of autologous nerve grafts, provide a scientific basis for clinical application of tissue engineering techniques for the regeneration and repair of peripheral nerve defects.

本课题在前期构建坐骨神经的三维导管支架材料的数字化研究基础上，以大白兔坐骨神经为“模板”、利用分辨率为0.001mm Micro-CT切割技术 ，以及Mimics17.0三维重建软件和数字化打印技术，利用具有导电性能的纳米碳和I型胶原混合，构建出具有坐骨神经三维解剖形态和细胞外基质结构的仿生数字化导电神经支架。研究其对促进雪旺细胞附着、生长和增殖，并模拟神经髓鞘的导电功能，刺激和引导神经生长及轴突再生方面的作用。将这种新型导电纳米碳人工神经导管支架植入到大白兔坐骨神经缺损模型中，以自体神经移植、生物膜神经导管、去细胞同种异体神经导管为对照组，利用大体观察、肌电生理技术、兔小腿三头肌湿重恢复率、组织学染色和扫描电镜技术对比观察不同神经导管材料对周围神经缺损的修复效果，不断的优化其性能，以期达到与自体神经移植相同或相近的效果，为采用组织工程技术修复周围神经缺损提供临床应用的科学依据。

以PLGA及明胶为原材料制备仿生多通道神经导管管植入新西兰大白兔坐骨10mm神经缺损处。以自体神经移植及单通道(1-CANC)神经导管作为对照组，通过组织学切片观察、肌电生理检测、逆向荧光示踪等实验探讨仿生神经导管定制化的多通道结构对周围神经轴突再生的作用。自体神经移植组在总体效果优于所有神经导管植入组(p<0.01)。有髓神经纤维计数结果显示:各CANC神经导管组之间有髓神经纤维数量无差异。但(2-CANC、3-CANC组)相对(1-CANC和4-CANC组)，在电镜下观察到了直径更大且髓鞘更厚的成熟神经轴突组织。类似的对比结果也出现在肌电生理检测、自噬行为及运动功能评定实验。逆行荧光示踪实验结果显示，CANC导管组中各组被荧光标记的神经元计数无统计学差异(p>0.05)，而其中被FB-NY双标记神经元比例最高的是1-CANC组(7.1%±2.4%)，4-CANC组最低(2.2%±1.2%)，结果具有显著差异(p<0.05)。. 在前期多通道仿生人工神经导管基础上，进一步通过多通道神经导管发现管腔横截面积大小及通道数量多少并不是神经导管多通道结构影响神经功能恢复的单一因素。采用梯度冷冻和冻干法制备了导电性增强、生物相容性好的多壁碳纳米管(MWCNT)-琼脂糖多微通道琼脂糖支架，MWCNT的加入并不影响琼脂糖的孔隙组成比和支架的形状记忆，但是0.025%wt的MWCNT在支架的膨胀平衡状态下提高了膨胀比和水含量。对照组、0.025%碳纳米管支架、0.05%碳纳米管支架和0.1%碳纳米管支架的电导率分别为(0.944±0.009)、(1.170±0.031)、(1.252±0.009)和(1.459±0.003)S/m。虽然高浓度的MWCNTs对RSC96细胞和pc12细胞的增殖影响不大，但不同浓度的MWCNTs对RSC96细胞神经丝在支架上的表达没有影响。通过在支架内植入细胞构建三维培养模型，我们观察到与ES结合时，RSC96细胞在支架纵轴上排列较好，与其他支架相比，在0.025% MWCNT-琼脂糖支架和0.05% MWCNT-琼脂糖支架上的粘附性较好。MWCNTs增强的琼脂糖支架在周围神经缺损中具有良好的应用前景。