柱花草磷高效基因型根系响应低磷胁迫的转录调控机制研究

Stylosanthes (Stylosanthes spp.) is one of the most valuable perennial leguminous grass in tropical and subtropical region in China. Low phosphorus availability of acid red soil is a major issue reducing the Stylo yield in this area. However, the molecular mechanism research of responding to low phosphorus stress and the key gene discovery is particularly urgent and necessary. This study with phosphorus high efficiency varieties as test materials, using cDNA-AFLP technology to establish Stylosanthes root cDNA Library induced by low phosphorus stress and obtain specific ESTs of transcriptional factors responding to low phosphorus stress .By homology cloning, electronic cloning and RACE methods to obtain the full-length gene of transcription factor related to low phosphorous stress and the positive recombinant gene transgenic plants. On this basis, the molecular characteristics, biochemical characteristics，expression pattern and biological function of transcription factor of root development under low phosphorus stress would be analyzed. This study can not only fill the blank of expression and regulation mechanism of transcription factor family member of Stylo roots responding to phosphorus stress but also rich legume transcriptional regulatory networks and to lay the foundation for the creation of new germplasm for low phosphorus tolerance of stylosanthes.

柱花草(Stylosanthes spp.)是我国热带亚热带地区最有价值的多年生豆科牧草之一，酸性红壤有效磷含量低是该地区柱花草生产中面临的重大问题，开展柱花草响应低磷胁迫的分子机理研究和关键基因的发掘尤为紧迫与必要。本研究以柱花草磷高效基因型为试验材料，利用cDNA-AFLP差异显示技术建立柱花草磷高效品种根系响应低磷胁迫的cDNA文库，筛选获得根系中磷胁迫应答转录调控特异ESTs；利用同源克隆、电子克隆和RACE方法获得磷胁迫应答转录因子基因cDNA全长，进而获得阳性重组基因转化株系。在此基础上，系统分析转录因子基因的分子特征、生化特征和表达模式，探讨转录因子调控柱花草根系抵御低磷逆境的生物学功能，阐明转录因子在柱花草根系响应低磷逆境中的作用及可能的调控机制。本项研究既可填补柱花草应答磷胁迫转录因子家族成员表达调控机制研究的空白，又能够为创造柱花草耐低磷新种质奠定基础。

柱花草(Stylosanthes spp.)是我国热带亚热带地区最有价值的多年生豆科牧草之一，酸性红壤有效磷含量低是该地区柱花草生产中面临的重大问题，开展柱花草响应低磷胁迫的分子机理研究和关键基因的发掘尤为紧迫与必要。本研究采用分子标记技术分离柱花草茎和叶在低磷胁迫下相关基因的差异表达片段，并对其进行生物信息学分析。结果表明，8对引物组合共扩增出差异片段195条，其中抑制型表达片段 56 条，诱导型表达片段 92 条，上调表达型差异片段 36 条，下调表达型片段 11 条，大小均在 50-1000 bp 之间。二次扩增后将特异性条带回收后进行测序，通过 blast比对，共比对出14条差异片段的同源序列，其中9个差异表达的核苷酸序列与已知功能基因有较高同源性，5 个序列与假定基因或预测基因同源性较高。采用RT-PCR方法从格拉姆柱花草[Stylosanthes guianensis （Aubl.）]中克隆出1个WRKY转录因子基因，命名为StWRKY45。该基因最大开放阅读框（ORF）为924 bp，编码307个氨基酸，分子量为35.62 kD，等电点为9.81。系统进化树分析表明，StWRKY45属于WRKY转录因子第II类WRKY基因，与拟南芥AtWRKY45、AtWRKY57亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明，在非磷胁迫下（对照），StWRKY45基因在柱花草幼苗的根、茎、叶中都有表达，但表达量均相对较低；在低磷胁迫下，StWRKY45基因在格拉姆柱花草根、茎、叶中的表达基本随胁迫时间的延长逐渐升高，且均在叶中的表达量最高；在低磷胁迫96 h时叶、茎中的相对表达量均达到最高，分别是对照的20.47倍、9.38倍，但在低磷胁迫72 h时根中的相对表达量达到最高。研究表明，StWRKY45基因受低磷胁迫诱导表达，推测StWRKY45基因可能参与柱花草对低磷胁迫的响应。进而获得阳性重组基因转化株系。在此基础上，系统分析了转录因子基因的分子特征、生化特征和表达模式，探讨了转录因子调控柱花草根系抵御低磷逆境的生物学功能，阐明了转录因子在柱花草根系响应低磷逆境中的作用及可能的调控机制。本项研究既可填补柱花草应答磷胁迫转录因子家族成员表达调控机制研究的空白，又能够为创造柱花草耐低磷新种质奠定基础。