目标区域测序搜寻中国汉族人群缺血性卒中易感基因及其机制研究

Ischemic stroke is a complex disease caused by genetic factors and environmental factors. It severely impairs the patients' health and life quality. The common variants reported in the genome wide association studies (GWAS) for ischemic stroke could only explain part of the risk, indicating that rare variants may play important roles in the pathogenesis of ischemic stroke. This project aims to high-throughput sequence the target regions reported in GWAS, searching for disease-associated common and rare variations. Combined with the known susceptible genes, we will comprehensively discover the genetic variations directly related to the susceptibility and prognosis of ischemic stroke. On this basis, we will further explore the effect of these genetic variants on the regulation of gene expression using a series of molecular biological methods. Our study will further clarify the possible biological mechanism of target region genetic variants involved in the occurrence and development of ischemic stroke, providing new theoretical basis and technical support for individual prevention and treatment as well as new drug research and development of ischemic stroke.

缺血性卒中是遗传因素和环境因素共同作用的复杂疾病，严重危害广大患者的生命健康和生活质量。目前，全基因组关联研究(GWAS)发现的缺血性卒中常见变异仅能解释部分发病风险，提示潜在的低频罕见变异在缺血性卒中的发病中可能发挥着重要作用。本项目拟通过新一代测序技术，将前期GWAS报道的缺血性卒中相关位点作为目标区域，进行高通量测序，搜寻疾病相关的常见变异和低频罕见变异，结合已发现的易感基因，全面发掘与缺血性卒中易感性和预后直接相关的遗传变异。在此基础上，采用一系列分子生物学方法深入探讨这些遗传变异对基因表达调控的影响。本研究将进一步阐明目标区域遗传变异参与缺血性卒中发生发展的可能生物学机制，为缺血性卒中的个体化防治及新药的研发提供新的理论依据和技术支持。

本项目拟通过新一代测序技术，将前期GWAS报道的缺血性卒中相关位点作为目标区域，进行高通量测序，搜寻疾病相关的遗传变异。我们首先采取全外显子测序技术，对30例大动脉粥样硬化卒中患者和30例健康对照在基因组范围内搜寻与疾病相关的位点，共发现位于861个基因的1,225个遗传变异与卒中易感性显著相关（P<0.05）。接着我们采用目标区域测序技术在146例样本（73例病例和73例对照）对上述结果进行验证。根据以下标准选择候选基因：（1）在全外显子测序中有统计学差异的变异（P<0.05）；（2）根据以往文献，与卒中发生发展相关的基因。根据上述标准，共选择了八个基因。八个基因的目标区域测序一共发现了415个遗传变异，其中12个遗传变异可能与卒中发病相关（P<0.10）。我们在验证I阶段（700例病例和566例对照）对上述12个位点进行验证，结果，只有PRKCH基因的rs1088680与卒中风险显著相关（显性遗传模型OR=1.33，95%CI=1.06-1.68，P=0.013；加性模型的OR=1.22，95%CI=1.04-1.45，P=0.018）。为了证实上述关联结果，我们在验证II阶段（798例病例和1,062例对照）中进一步对rs1088680进行基因分型，并且发现该位点与卒中风险仍然显著相关。把发现阶段和两个验证阶段进行合并，我们发现PRKCH基因的rs1088680位点与LAA卒中风险显著相关（显性模型OR=1.37，95%CI=1.19-1.59，P=2.08×10-5；加性模型OR=1.24，95%CI=1.12-1.38，P=6.72×10-5）。我们用RNAfold预测PRKCH基因的rs1088680 C/T对该基因RNA二级结构的影响。结果发现，rs1088680 C/T变异可以明显改变该基因的RNA结构。我们在HaploReg数据库中发现，rs1088680遗传变异可以影响包括大脑在内的多个组织的染色质状态。同时，rs1088680在4个组织中被归类为基因启动子，在14个组织中被归类为增强子，在2个组织中与DNA酶位点重叠。在全血中，rs1088680是PRKCH表达水平的eQTL（P=9.8×10-5），进一步表明PRKCH是缺血性卒中的潜在致病基因。