海参自溶初期线粒体相关凋亡信号蛋白分子的激活机理研究

Sea cucumber would initiate the autolysis which lead to skin melting and hydralysis during fishing,transport and processing. The sea cucumber processors was puzzled by this phenomenon. Up to now, the studies of autolysis in sea cucumber mainly focus on enzymology field. By means of cell apoptosis, the signal protein molecules triggered the precursor autolysis enzyme, finally the autolytic enzyme result in autolysis. But which signal moleculars involved in the autolysis activitation, and how they worked were still unknown. This project aimed to find out the signal pathway that ignited the sea cucumber apoptosis and finally result in autolysis. Firstly, the immunohistochemical staining method was adopt to discover the Ca2+ distribution and the changing of Mitochondrial transmembrane potential (△Ψm) in initial stage. Secondly, the Western Blotting was adopt to explicit the apoptosis activition relationship of Bcl-2、cytochromeC、AIF、Apaf-1、Caspase-9. Finally, we would detected the activation of Caspase-3 that the key effector molecule of the apoptosis. We hope the detection can help to reveal the mechanism of the sea cucumber autolysis in the angle of mitochondria apoptosis.

海参在捕捞、运输及加工过程中常发生强烈的自溶现象，导致"化皮、溶解"， 这一现象困扰着海参的加工业。迄今对海参自溶的研究主要集中于海参自溶酶的酶学研究。海参自溶是由细胞凋亡中的信号蛋白分子激活自溶酶所导致。而在海参自溶酶激活前到底由哪些信号蛋白分子参与凋亡的发生，以及它们如何参与自溶酶的激活等问题均未见有研究。本项目拟从凋亡信号传导的角度研究海参自溶现象。首先采用免疫组化法研究海参细胞内Ca2+的分布变化和线粒体跨膜电位(△Ψm)变化，了解线粒体凋亡的起始；其次采用Western Blotting法对线粒体相关信号分子Bcl-2、细胞色素c、AIF、Apaf-1、Caspase-9相互激活进行研究，探明线粒体参与海参凋亡的分子机制；最后通过对凋亡关键效应分子Caspase-3酶的激活，明确海参凋亡分子信号对自溶酶激活的影响。以期从细胞凋亡的角度，以线粒体凋亡的研究为切入点揭示海参自溶机理。

刺参(Stichopus japonicus)是一种名贵的水产品，具有极高的市场价值。但刺参在某些状况下，例如高温、高盐、营养匮乏、紫外线或阳光照射等情况下会发生自溶现象，这对刺参的养殖、加工、运输等产业环节都造成了困扰。如何深入认识刺参自溶机制成为亟待解决的问题。本项目通过建立紫外照射诱导刺参自溶模型，研究刺参各器官组织凋亡相关信号分子表达激活作用，力图从分子水平认识刺参自溶的机制。.通过TUNEL组织切片染色和Caspase-3组织染色技术发现，在紫外诱导刺参30min后，刺参体壁细胞即出现DNA片段化和Caspase-3激活表达现象，并随着时间的延长逐渐升高。DNA片段化和Caspase-3的激活是细胞发生凋亡的重要证据。而TCA可溶性寡肽和羟脯氨酸的含量此时则并未发生明显变化。这说明刺参自溶现象是由细胞凋亡所引发的。对紫外诱导刺参的细胞色素c（Cyt c）的研究发现，紫外诱导30min后Cyt c逐渐从线粒体内迁移至细胞胞浆内，并且线粒体膜电位也同时发生反转，Caspase-9发生激活。线粒体膜电位的崩溃会引发Cyto c逐渐从线粒体向细胞质迁移，并导致一系列信号分子激活最终活化Caspase-9 和Caspase-3，从而引发细胞凋亡。本研究表明刺参凋亡是由Cyto c介导的Caspase-3依赖的细胞凋亡事件。Bcl-2家族蛋白是关键信号蛋白分子，既包括抑制细胞凋亡的信号分子如Bcl-2，也包括促进细胞凋亡发生的Bax蛋白因子。Bcl-2可通过调节线粒体膜的通透性导致Cyt c的释放，从而导致凋亡。对Bcl-2 和Bax采用Western Blotting方法进行研究。发现在刺参紫外诱导后Bcl-2的表达逐渐降低，而Bax的表达水平逐渐升高。说明刺参细胞凋亡途径是借由Bcl-2途径引发的Cyt c依赖的凋亡途径。.本项目的研究结果表明，刺参自溶现象是由细胞凋亡机制所引发的，通过Bcl-2凋亡因子的调控导致线粒体膜电位崩溃，Cyt c外溢，进而激活Caspase-9 和Caspase-3，从而导致刺参细胞凋亡的发生。刺参细胞凋亡早于自溶现象发生，说明刺参自溶是由细胞凋亡机制所引发的。这一实验结果是首次在科学上确定刺参自溶机理是介由线粒体凋亡途径所引发的。对重新审视刺参自溶机制提供了全新的视角。