中华鲟性别特异性标记的鉴定及其特征分析

The Chinese sturgeon (Acipenser sinensis), being critically endangered, is an anadromous fish. It seems impossible to identify the sexes according to the external morphology, because of the similarity of secondary sexual characteristics on sturgeons. An exact and non-injury identification of the sexes at an early life stage would contribute to selectively breeding, the sex-ratio survey and resources conservation of wild sturgeon. At present, the presence of males in gynogenetic progeny suggested that a female sturgeon was a genetic basis of heterogametic {ZW (female)/ZZ (male)} sex-determination. In this project, whole-genome sequencing is used to identify Chinese sturgeon sex-specific molecular markers, which are validated using PCR on additional individuals; PCR with the markers is performed to find whether or not it is conserved in other Acipenser species; the characterization of the nucleotide sequences of the markers is determined by reads assembling, DNA walking and quantitative PCR, and we analyze whether or not the marker is related to sexual differentiation. The research on identification and characteristics of sex-specific markers would provide an important resource for studies on sex-determination mechanism. Improving the accuracy and shortening the period of the sex identification on sturgeon would contribute to artificial breeding and restoration of Chinese sturgeon; at the same time, this research would offer a valuable technical support for the development of caviar production by reducing the costs of breeding more males.

中华鲟为大型溯河产卵洄游性鱼类，处于极度濒危状态。鲟鱼雌雄个体之间无明显的第二性征，无法从外部形态上区分雌雄个体。准确无损伤地鉴定中华鲟性别，有助于其野生种群性别监测、资源保护和有选择地进行人工养殖。雌核发育研究表明，雌性鲟鱼为异形配子的性别决定遗传方式，暗示雌雄个体间存在决定性别的特异基因组片段。本项目拟采用低覆盖全基因组（5×）测序方法筛选中华鲟性别特异性分子标记；利用PCR在种群中验证候选性别标记的有效性及在鲟科鱼类中的通用性；通过序列组装和DNA步移方法延伸标记序列长度、解析其结构特征，并结合标记所属或相邻基因在雌雄个体间的差异性分析，阐述所得标记及其所属或相邻基因与性别分化的相关性。本项目将为鲟鱼性别决定和分化研究奠定基础,并有助于中华鲟鱼性别鉴定、为中华鲟繁育和增殖放流等物种保护研究提供指导；同时，鲟鱼性别标记的开发及应用将有效提升鲟鱼子酱产业的效益。

鲟鱼雌雄个体之间没有明显的第二性征，并且性成熟时间较长。早期从形态上无法辨别雌雄。不仅不利于中华鲟（Acipenser sinensis）自然种群性别监测，而且也不能够依照雌雄性别分别进行集约化养殖或一定性别比例进行饲养，造成饲养过多雄性个体的资源浪费，增加了养殖成本，阻碍了中华鲟人工养殖、种群复壮以及其它鲟鱼的产业快速发展。因此，筛选鲟鱼性别特异性标记不仅对中华鲟繁育、增殖放流和野外群体性别比例监测等保护研究提供指导，还为鲟鱼子酱产业发展提供帮助。本项目利用比较基因组学方法筛选鲟鱼的性别特异性分子标记，以及在不同鲟科鱼类中验证其有效性，并初步分析性别特异性DNA片段特征。由于中华鲟处于极度濒危，本研究首先利用同样具有约260条染色体的施氏鲟（A. schrenckii）作为筛选性别标记的对象。通过对雌雄各20尾施氏鲟进行高通量测序，每个个体获得约40 Gb数据，利用本项目组开发的性别标记筛选脚本，成功筛选到6个雌性性别特异性标记。其中两个雌性性别特异性标记（SSM4和SSM6）在中华鲟中具有通用性，并且这两个性别特异性标记在长江鲟（A. dabryanus）、达氏鳇（Huso dauricus）、俄罗斯鲟（A. gueldenstaedtii）、欧洲鳇（H. huso）、小体鲟（A. ruthenus）、闪光鲟（A. stellatus）、西伯利亚鲟（A.baerii）、大杂（达氏鳇♀×施氏鲟♂）和西杂（西伯利亚鲟♀ ×施氏鲟♂）具有通用性。利用染色体步移法分析性别特异性DNA片段结构特征发现SSM4和SSM6在同一条序列上。另外，以上研究结果也表明了鲟科鱼类的性别决定方式为ZW型。本项目的研究结果不仅为濒危鲟鱼和养殖鲟鱼提供了快速鉴定性别的分子技术，同时为进一步探讨鲟鱼性别决定提供了研究基础。