水稻基腐病菌毒素zeamine的抗性基因克隆及其功能分析

Dickeya zeae is the causal agent of the rice foot rot disease. The pathogen produces toxins that inhibit the germination of rice seeds, whereas toxin-minus mutants are not able to inhibit rice seed's growth, demonstrating that the toxins are the key virulence determinants. Chemical structure analysis unveiled two polyamino compounds, i.e., zeamine (C49H105O4N6) and zeamine II (C40H88ON5), accounting for 60% and 40% of the total toxins produced, respectively, and both are potent antibiotics, but the mechanism of action remains unknown. In addition, inoculation results with about 30 rice cultivars showed that most of them are highly susceptible to D. zeae infection. In this study, we aim to screen for zeamine-resistant genes from the toxin producer EC1 and other zeamine-resistant bacteria, identify and characterize these genes and understand the mechanisms of toxin resistance. The results will help to understand how D. zeae could resist the zeamines, unveil the mechanism of action of zeamines, and provide useful toxin-resistant genes for construction of biocontrol agents and for rice engineering to control diseases.

水稻基腐病原细菌（Dickeya zeae）可产生抑制水稻种子萌发的毒素，我们前期工作表明该毒素是重要的致病因子，毒素合成基因突变体丧失抑制水稻种子萌发的能力。经分析，该毒素含有两个组分，其中组分zeamine（C49H105O4N6）占EC1产毒量的60%，组分zeamineⅡ（C40H88ON5）占40%，且均具有抗菌活性，但zeamine的作用机理不明，且人工接种试验表明目前尚无抵御D. zeae的高抗水稻品种。本项目拟在前期研究基础上，运用基因组大片段酶切或Tn5转座子插入突变的方法，经毒素抑菌活性检测，筛选毒素抗性丧失的突变体，以求从产毒菌EC1及其它细菌中克隆zeamine毒素的抗性基因，并利用基因敲除、功能互补等手段进行功能验证，研究结果将有助于揭示zeamine的作用机理，阐明D. zeae抵抗zeamine的机制，提供新的抗性基因用于生防菌构建及转基因防治病害。

本项目对水稻基腐菌D. zeae EC1的产毒培养基进行优化，获得了高产毒培养基LS5，其zeamines产量比基础培养基高约30倍，为后期zeamines抗性基因和抗性菌株的筛选奠定了基础。同时，为便于抗性基因的鉴定及其调控机理解析，我们完成了对EC1的全基因组测序分析并对产毒菌EC1通过Tn5转座子插入突变获得了49,010株突变株，通过毒素抑菌活性检测筛选到两株抗性减弱8倍的突变菌株，通过hi-TAIL PCR和生物信息学分析，鉴定到EC1中两个zeamines抗性相关系统，分别为RND类外排泵DesABC介导的zeamines抗性和Zrg基因簇介导的zeamines抗性。前者敲除desA、desB基因和desC基因后，对zeamines的MIC分别降低了8、8和32倍，通过比较菌株对zeamines及同类抗生素在不同条件下的耐受能力，发现DesABC对zeamines的抗性主要源于其对zeamines的直接转运作用和介导了zeamines及同类抗生素的靶标的保护；后者Tn5插入在一个多基因（BCADTEF）的操纵子中，命名为zrg 基因簇，操纵子当中的ABCDT基因与zeamines的抗性有关。通过提取基因簇中各基因突变体的脂多糖，发现△zrgC、△zrgA和△zrgE核心多糖缺失，△zrgF上O-抗原缺失，核心多糖和脂质A增多，表明zrg基因簇参与了脂多糖合成，而△zrgB、△zrgD和△zrgT的脂多糖结构与野生型EC1相似，但其zeamines产量显著降低。在抗zeamines菌株筛选方面，从土壤中分离出5,000个菌株，筛选到7株对zeamines抗性增强200倍以上的菌株，选其中抗性最强的两株菌株进行深入研究。进一步实验证明，这两株菌可能产生zeamines降解酶。对菌株LS465通过构建Fosmid文库（含4,000多个阳性转化子），筛选到30个对zeamines抗性较高的转化子，其中有F2、 F3 、F4、 F5 、F6 、F7对zeamines抗性超过大肠杆菌的40倍。现已对其中五个转化子的全部序列进行分析，为明确LS465抗zeamines毒素的通路和整个抗性机制，构建了Tn5转座子突变体库，已从7,000株突变株中筛选出16株抗性减弱的突变体。综上所述，本项目顺利完成课题预定目标，共发表8篇科研论文，其中SCI收录论文7篇，并申请专利2项