Fascin-1参与喉鳞癌细胞侵袭运动及转移的分子机制研究

癌细胞在疾病早期获得侵袭运动的能力与其特异性的细胞迁移运动相关基因表达增加有关。本项目在前期研究基础之上，将继续着眼于与细胞运动密切相关基因Fascin-1的研究，探索Fascin-1参与侵入性伪足形成并介导喉鳞癌细胞侵袭的分子机制。首先拟建立可调控Fascin-1表达的四环素调控真核表达体系喉鳞癌细胞株，在此基础上研究Fascin-1表达下调对喉鳞癌细胞骨架结构F-actin以及侵入性伪足形成的影响，并进一步探讨Fascin-1表达下调是否导致癌细胞黏附、迁移及侵袭能力降低。重点是明确Fascin-1参与的喉鳞癌细胞侵袭过程与喉软骨抵抗癌细胞浸润的屏障作用之间的关系，以及Fascin-1发挥调节喉鳞癌细胞运动能力的功能是否需要PKC结合特性和actin结合特性的共同调控，期望能为喉鳞癌抗侵袭分子机制的研究、抗喉鳞癌转移治疗特异性靶点的选择以及癌细胞转移的早期有效预测奠定基础。

本课题着眼于与细胞运动密切相关基因Fascin-1，研究了Fascin-1 参与侵入性伪足形成并介导喉鳞癌细胞侵袭的分子机制。首先建立了可调控Fascin-1 表达的四环素调控真核表达体系喉鳞癌细胞株，在此基础上研究了Fascin-1 表达下调对喉鳞癌细胞骨架结构F-actin 以及侵入性伪足形成，以及癌细胞黏附、迁移及侵袭能力的影响。明确了Fascin-1 参与的喉鳞癌细胞侵袭过程与喉软骨抵抗癌细胞浸润的屏障作用之间的关系，发现Fascin-1发挥调节喉鳞癌细胞运动能力的功能需要PKC 结合特性和actin 结合特性的共同调控。主要研究成果有：（1）通过建立四环素Tet-on 基因开关调控系统实现在细胞和动物水平对Hep-2 细胞中Fascin-1 基因表达时间和表达水平的“开/关”式调控，结果显示特异性好，能有效调控Fascin-1的表达。（2）通过F-actin荧光探针检测Hep-2细胞骨架结构改变，发现抑制Fascin-1蛋白表达的同时破坏了Hep-2细胞骨架结构的完整性。激光共聚焦显微镜观察结果发现Fascin-1蛋白表达下调导致Hep-2细胞表面丝状伪足减少，且降低了Hep-2细胞的增殖、黏附、迁移及侵袭的能力。（3）通过在Transwell 侵袭小室模型的基础上建立半离体实验模型以及裸鼠体内耳廓皮下移植侵袭模型，模拟喉鳞癌细胞对周围组织尤其是软骨组织的侵袭过程证明Fascin-1 表达状态会影响喉鳞癌Hep-2 细胞对软骨侵袭的特异性。（4）通过将不受针对内源性Fascin-1 的shRNAs 干扰的Xtfascin-1，及其两种不同功能突变亚型Xtfascin-1S33A（无PKC 结合特性）和Xtfascin-1S33D（无actin 结合特性）导入Hep-2 细胞，观察基因功能恢复后癌细胞的运动状况，实现对PKC和actin 结合特性调控作用的分别研究，从而确定了PKC 和actin 结合特性是Fascin-1 功能发挥的关键调控点。