去甲基化药物重塑肿瘤微环境提高PD-1单抗疗效的机制研究

The reversal of inhibitory tumor microenvironment by epigenetic regulation is a hot topic in tumor immunotherapy in recent years. Our previous research results suggest that demethylating agents can improve the number of tumor-infiltrating lymphocytes, IFN-γ level and improve tumor sensitivity to immunotherapy in the microsatellite stable model of colorectal cancer that is not sensitive to PD-1 bockades. However, the mechanism is not clear. Therefore, this study is to further explore and clarify the effects of demethylation drugs on tumor cells, vital immune cells of DC, T, NK cells and the changes of immunological characteristics by methylation sequencing, RNA-seq and other techniques. To explore the mechanism of demethylation drugs remodulating tumor microenvironment by single cell sequencing and multispectral imaging, to provide theoretical basis for the combination of demethylation drugs and immunotherapy, and reference for evaluating the immune status of tumor microenvironment. We would establish the IFN-γR-/-gene deficient mice and immune cells deficiency mice model to analyze the key role of IFN-γ, DC and T cells in anti-tumor immune response, and to elucidate the specific mechanism of demethylation drugs to improve the efficacy of immunotherapy. It provides a scientific evidence for immunotherapy to expand the beneficiary population.

通过表观调控的手段对肿瘤微环境免疫受抑状态进行逆转是近年来肿瘤免疫研究的热点。我们前期的研究结果发现，在对PD-1单抗不敏感的微卫星稳定的结直肠癌模型上，去甲基化药物可以通过增加T细胞的浸润和IFN-γ水平，提高肿瘤对PD-1单抗的免疫治疗的敏感性，但其机制尚不明确。因此，本课题拟通过甲基化测序、RNA-seq等技术进一步探究和明确去甲基化药物对肿瘤细胞和DC、T、NK等关键免疫细胞的影响及其IFN-γ响应等免疫特性的变化；通过单细胞测序技术和多光谱成像技术探讨去甲基化药物重塑肿瘤微环境的机制IFN-γ相关信号通路的影响，利用IFN-γR-/-基因缺陷小鼠和免疫细胞清除小鼠，解析IFN-γ及DC、T细胞等在抗肿瘤免疫应答中的关键作用，阐明去甲基化药物重塑肿瘤免疫微环境后提高PD-1单抗疗效的关键因素，为利用去甲基化药物优化免疫治疗方案及提高疗效提供理论依据。

如何提高PD-1/PD-L1单抗的疗效、扩大受益人群成为了重要的研究方向。通过表观调控或代谢重编程等手段对于肿瘤微环境免疫受抑状态进行逆转已经成为近年来肿瘤免疫研究的热点。本研究探究了去甲基化药物地西他滨对肿瘤细胞、免疫细胞以及对肿瘤微环境重塑的影响。研究发现，DAC的表观遗传调控作用可以开放某些肿瘤抗原、MHC等基因，改变了肿瘤细胞的免疫学特性和代谢特征，尤其是脂质代谢，提高肿瘤的免疫原性，增加肿瘤抗原提呈，进而改变肿瘤微环境，产生IFN-γ和增加T细胞的浸润。同时DAC也可以显著提高DC细胞抗原提呈分子的表达，增强T细胞的IFN-γ分泌水平，增加中央记忆T细胞的数量，提高M1巨噬细胞的数量，增强抗肿瘤作用。荷瘤小鼠模型中分析发现，总体上，DAC重塑后的肿瘤微环境中，抗肿瘤效应相关的免疫细胞（如Xcr1+DC，中央记忆性CD8+T、CD4+T，Bri3bp+单核细胞等）数量增多，而促进肿瘤生长的相关免疫细胞（如Fscn1+DC，CXCR+4NK等）减少，全面提高了肿瘤微环境中的抗肿瘤作用，也为PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂提供良好的条件。此外，研究还发现T细胞中增殖相关的基因（如CD69、Ki67）显著上调，而共抑制信号分子显著下调（如LAG-3、TIGIT、PD-1等）；肿瘤微环境中IFN-γ表达水平显著提高，其主要在NK、T细胞和肿瘤细胞中表达。在这些细胞中，IFN-γ相关信号通路基因表达水平显著上调。提示DAC处理后的肿瘤微环境对免疫治疗的敏感性增加。本研究结果有助于我们加深对去甲基化药物提高PD-1单抗治疗疗效的认识，为去甲基化药物与PD-1单抗治疗的联合提供理论依据，也为评估肿瘤微环境的免疫状态提供参考和证据，拓宽PD-1/PD-L1单抗的受益人群。