新型丝素蛋白超声微泡介导的基因递送研究

The properties of microbubble ultrasound contrast agents such as the stability in vivo,the acoustic and interface properties of shell materials have a great effect on gene delivery and transfection efficiency. It is important to find an ideal gene carrier to direct gene transfer into target cells safely and efficiently, which is also a prerequisite for gene therapy. It is well known that silk fibroin from natural silkworm cocoon have good biocompatibility and mechanical properties and have been widely used in the field of tissue engineering. The active surface amino acid residues of silk fibroin are benefited for cell adhesion and gene transfection. Based on this, a novel ultrasound contrast agent is designed and fabricated by coaxial electrosrpay technology and silk fibroin are been used as shell material. Meanwhile this project also establishes a new co-culture model with endothelial cells layer and cancer cells layer through an interdisciplinary combination of approaches that includes tumor biology, stress biology and ultrasound molecular imaging. The stability and acoustic characteristic of ultrasound contrast agents and target cell adhesion and gene transfection are investigated in vitro and in vivo. The project may provide meaningful design considerations for microbubble ultrasound contrast agents fabrication and the gene transfection efficiency may be enhanced and the tumor diagnosis and gene therapy purposes can be fulfilled.

超声微泡造影剂在体内的稳定性、声学特性及成膜材料的界面性质直接影响基因递送和转染效率。寻找一种理想的基因载体，安全高效的将目的基因导入靶细胞是超声微泡介导基因递送和转染的关键，也是基因治疗的前提条件。天然丝素蛋白以其良好的生物相容性及良好的力学性能被广泛用于组织工程领域，同时其表面的活性氨基酸残基位点利于细胞的黏附和基因转染。基于此，本项目利用同轴静电电喷技术，以丝素蛋白为外壳材料构建新型丝素蛋白超声微泡造影剂；同时基于微泡载体在肿瘤组织内的传质过程，结合肿瘤生物学、超声影像学、力生物学等综合学科的研究方法及技术，建立新型含内皮细胞层、肿瘤细胞层的共培养模型。从离体水平和在体水平考察微泡载体的稳定性、声学特性、与靶细胞的黏附性及基因转染率。本项目旨在构建新型超声造影剂，既能增强基因转染率实现靶向治疗又能特异性显影实现分子影像的诊断目的。

本项目旨在设计与构建新型超声造影剂，采用同轴静电电喷技术、双乳化法以及自组装等方法，以丝素蛋白、磷脂材料以及PLGA、PVA等高分子材料为膜材，携载目的基因、化疗药物、光敏物质、液气相变液态氟碳等功能元件，研究了新型超声造影剂靶向肿瘤细胞，进行分子显像与治疗，为实现肿瘤的诊疗一体化提供参考。经过本项目的研究，获得了静电电喷技术制备丝素蛋白载药纳米粒的工艺参数；制备了不同膜材液气相变型载药纳米粒，实现超声显像与智能调控药物释放；建立了体外评价纳米探针寻靶细胞模型；制备多种新型多模态显像造影剂并进行体内外评价。研究内容包括：1）同轴电喷法制备具有核壳结构的载药/基因纳米粒。选用PVA和丝素蛋白为载体材料，以绿色荧光蛋白基因、盐酸阿霉素为模型基因／药物，通过超声刺激，靶向调控药物的释放。2）相变纳米粒时序性显像与释药研究。利用乳化法，分别选取磷脂、PLGA为膜材制备纳米探针，包裹液气相转变液态氟碳以及化疗药物盐酸阿霉素，使用自主设计的低功率聚集超声系统辐照，时序性激发纳米探针相变实现超声显像。结合UTMD效应，击破载药微泡，调控药物释放，达到诊疗一体化目的。3）相变纳米粒增效微波消融研究。制备PLGA纳米粒，包裹不同比例混合的液态氟碳，并携载药物。微波消融肿瘤的同时，可诱发纳米粒相变，实现超声显像，并释放药物，杀死残留癌细胞。4）载ZnPc液气相变型纳米粒用于乳腺癌光声/超声成像及治疗研究。以PLGA为载体材料，将吸光物质ZnPc、液气相变试剂PFH，共同包裹于纳米探针中，探针表面修饰RGD多肽，实现乳腺癌诊疗一体化。5）新型产气脂质体设计与制备研究。选用磷脂作为外壳，碳酸氢铵溶液作为内核，制备包裹碳酸氢铵的脂质体，研究其产气性质及增效HIFU治疗乳腺癌研究。结果表明，新型产气脂质体具有良好的体内增效HIFU消融肿瘤的作用，具有成为肿瘤诊疗一体化多功能探针的潜能。本项目发表论文9篇，其中SCI论文7篇。申请专利2项，其中1项获授权，1项实质审查中。