生物转化废弃油脂合成ω-羟基脂肪酸研究

ω-Hydroxy fatty acids are important precursors for biodegradable polymer materials. Due to the hydroxyl group in the inactive terminal of the carbon chain, it is difficult to specifically synthesize these compounds using traditional chemical processes. Waste oils are abundant resources. Therefore, microbial preparation of ω-hydroxy fatty acids using these resources is attractive. However the microbial process is facing problems with low enzymatic efficiency and poor product specificity, etc. In this study, fatty acid ω-hydroxylases of different origins will be cloned and evaluated. Then, site-directed mutagenesis strategies will be used to increase the enzyme activity, and product specificity, etc. Finally, a heterologous system will be constructed to convert waste oils efficiently to their ω-hydroxyl products using fermentation technology. This study is expected to lay the foundation for microbial synthesis of ω-hydroxy fatty acids.

ω-羟基脂肪酸是合成生物可降解聚合材料的重要单体，由于其羟基位于不活泼的碳链端，传统的化学工艺很难特异性地合成此类化合物；废弃油脂资源丰富，利用微生物将其转化制备高附加值的ω-羟基脂肪酸已成为国际上的研究热点。针对生物转化过程中酶的产物专一性不高、转化过程效率低等问题，拟开展不同来源脂肪酸ω-羟化酶基因的克隆及功能评价、脂肪酸ω-羟化酶的改造、以废弃油脂为底物合成羟基脂肪酸合成体系等研究，解析脂肪酸ω-羟化酶催化特异性羟化的机制及酶结构和功能的关系，创制选择性的羟化酶，在此基础上，构建可以转化重要生物质资源糖和废弃油脂制备特殊羟基脂肪酸的工程菌，合成专一性的ω1、ω2及ω3等羟基脂肪酸，解析影响工程菌转化的限制因素，提升工程菌的转化效率，为生物法合成特定的羟基脂肪酸奠定基础。

羟基脂肪酸是一种重要的化工原料，广泛应用于化学、生物、食品及绿色聚合物材料等行业。近年来，利用生物法制备羟基脂肪酸已经引起了相关研究者的重视，这对解决化学合成所带来的环境污染问题具有重大意义。本项目的工作完成了不同来源脂肪酸ω-羟化酶基因（拟南芥的LCR，枯草芽孢杆菌的YetO和巨大芽孢杆菌的P450BM3）的克隆及功能评价，采用全细胞催化转化脂肪酸的方法测定了P450BM3底物链长特异性和产物羟基位置特异性，发现P450BM3对C12、C14脂肪酸显示出较高的活性，其催化产物中，ω-3-羟基脂肪酸比例较高。进一步通过异源表达P450BM3的方法构建了转化废弃油脂在特定位置羟化生成ω-羟基脂肪酸的工程菌株，并对具有特定链长的羟基脂肪酸的转化条件进行了优化。结果表明，共表达P450BM3和葡萄糖脱氢酶GDH的工程菌株具有最高的转化效率，该菌株在以2.5mM十二酸为底物时，十二酸的转化率为96.2%，羟基十二酸产量为529.0mg/L，但随着底物中脂肪酸碳链的延长，其羟化效率和产量有下降趋势。在以上工作的基础上，对脂肪酸ω-羟化酶P450BM3进行了理性设计和定点突变研究，获得的突变酶P450BM3J具有对非天然底物C5-C6一元醇的催化能力，能够催化其生成二元脂肪醇，进一步的改造有效加强了C5-C6二元醇的合成速率，高特异性合成了α,ω3-二元醇。以上研究加深了对脂肪酸ω-羟化酶的认识，为采用生物催化转化技术制备ω-羟基脂肪酸和二元脂肪醇奠定了基础。通过本项目的实施，目前已发表SCI论文15篇，申请发明专利5件，依托此项目共培养研究生3名。