β-catenin/SOX9 互反馈调控环路的作用机制及其在构建稳态骨骺干细胞中的作用

精确调控骨髓间充质干细胞(MSC)分化可望构建稳态骨骺干细胞(PCSC)，但机制不清。而SOX9是控制MSC分化为软骨的关键因子，功能由N/C末端同源结构域控制；Wnt双向控制MSC分化并抑制其分化为软骨细胞，β-Cat是关键，功能受其磷酸化状态控制，β-Cat与SOX9间可能存在相互调控。.因此推测：Wnt-SOX9间存在互反馈调控环路，其机制通过调控β-Cat磷酸化及SOX9的N\C末端激活状态实现；该环路动态控制MSC分化为PCSC并稳定表达。.为验证假设，拟观察β-Cat与SOX9在MSC不同功能状态的表达及关联，并重点观察SOX9调控β-Cat磷酸化及后者对前者N/C末端功能的影响，最后探讨该环路对MSC分化进程的动态调控作用，从而验证Wnt-SOX9互反馈调控环路的存在及其分子机制以及对通过调控MSC分化构建稳态PCSC作用及其机制，为精确控制MSC分化，促软骨重建提供理论依据

研究背景：SOX9是诱导MSCs经过PCSCs分化为软骨细胞的关键因子，可以影响MSCs凝聚，而且决定MSCs向软骨细胞分化。Wnt信号通路在软骨细胞的生长发育、增殖、分化、迁移、凋亡及稳态维持方面起着重要作用，可正向和负向调节MSCs向软骨细胞的分化。大量研究综合分析推测，Wnt与SOX9之间可能存在双向的互反馈调控环路，但其机制尚不清楚。.研究目的：探究Wnt与SOX9之间的调控环路机制，从而精确发挥SOX9以及Wnt在二元控制干细胞分化方向和进程中的作用，以构建稳态骨骺干细胞，用于组织工程。.主要内容：.1.骨髓间充质干细胞的体外培养、纯化及鉴定；2.骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化过程中各时期软骨指标及Wnt通路蛋白的表达情况；3.Wnt通路在骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化过程中各时期的作用；4.骨髓间充质干细胞SOX9过表达慢病毒构建及Sox 9表达鉴定；5.Sox9在骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化过程中各时期的作用；6.Sox9对Wnt通路的负反馈调节机制。.重要成果：.1.成功检测了MSCs增殖/分化状态下的SOX9蛋白的表达、活性特点；2.成功检测了MSCs增殖/分化状态下的Wnt通路相关蛋白的表达、活性特点；3.成功构建PEGFP-SOX9过表达慢病毒；4．成功构建PEGFP-N1-SOX9全长质粒，以及PEGFP-N1-△N-SOX9 N端缺失质粒和PEGFP-N1-△C-SOX9 C端缺失质粒；5．详细研究了Wnt通路对于MSCs诱导分化为软骨细胞过程中所起的作用和影响；6. 探究了Sox9基因对于Wnt通路的反馈表达调控作用及其机制；7. 探讨了β-catenin-SOX9互反馈调控环路在MSCs构建PCSCs中的作用及机制.科学意义：.本项目检测了MSCs成软骨诱导分化过程中各时期软骨指标及Wnt通路蛋白的表达情况，详细研究了Wnt、Sox9在此过程中的作用及相互调控机制，为精确调控MSCs分化为软骨细胞，应用于组织工程治疗软骨缺损打下了坚实的基础。