番茄ACEP60基因的抗病性调控功能与机理分析

植物蛋白酶抑制子对植物抗病性起重要调控作用，但其作用机理的研究还不够深入。本项目在已克隆了一个可能的胰蛋白酶抑制子基因ACEP60，发现它对Cf基因介导的HR起重要调控作用，初步证明ACEP60是作为HR调控因子或抗病信号传导因子的新型胰蛋白酶抑制子基因的基础上，拟联合生物化学、遗传学和分子生物学等多种方法研究该基因对各类病害抗性的调控作用，鉴定该基因产物是否有抑制子活性，明确其抑制子活性是否为该基因调控抗病性所必需。此外，用ACEP60为诱饵蛋白筛选文库，鉴定其可能作用的靶蛋白，并经VIGS验证功能，揭示ACEP60基因的抗病性调控机理。所获结果可进一步明确植物蛋白酶抑制子对植物抗病性的调控作用，揭示植物蛋白酶抑制子的抗病性调控机理，增进对植物抗病分子机理的理解，为进一步研究抗病信号途径提供新的切入点，可望为抗病分子育种提供有利基因资源和中间材料。

植物抗病基因(R)与病原菌无毒基因(Avr)产物间的直接或间接相互作用而产生的“基因对基因”抗性是植物抗病性的重要形式。番茄（Lycopersicon esculentum）与叶霉菌（Cladosporium fulvum）互作是研究基因对基因假说的模式系统。.ACEP60是由徐等通过差异蛋白质组学分析Cf-4（HR-）、Cf-4/Avr4 (HR+)、Avr9(HR-)及Cf-9/Avr9 (HR+)四种基因型番茄，在HR+获得的上调表达蛋白。由于采用的是一套不涉及病原物接种的HR和抗性分析检测技术，所以认为ACEP60的功能和角色是作为HR调控因子或抗病信号传导因子，而不是对病原物的直接抗菌作用因子；ACEP60对HR和抗病调控作用很可能是通过抑制植物自身、而不是病原物的靶蛋白来实现.本论文主要研究内容及结果如下：.1.从番茄中克隆获得去除信号肽的ACEP60基因开放阅读框（ORF）；利用重叠延伸PCR技术，获得可能的关键氨基酸精氨酸（Arg）突变为丙氨酸（Ala）的ACEP60 ORF；分别构建原核表达载体pET32a(+)，获得纯化的ACEP60蛋白。已知晶体结构的1R8N为模型，同源模拟ACEP60的三级结构，表明精氨酸是该蛋白是否具有活性的关键氨基酸。.2.克隆获得番茄ACEP60 ORF与本氏烟中ACEP60 基因片段，通过重叠延伸PCR技术获得的Arg突变的番茄ACEP60 ORF。分别构建植番茄ACEP60非突变和突变超表达载体以及融合FLAG的ACEP60非突变超表达载体；本氏烟ACEP60的RNA干扰载体，通过农杆菌介导叶盘法，分别对本氏烟进行遗传转化，共获得超表达野生型3株、超表达突变型2株及RNAi型5株。HR检测表明，ACEP60表达强弱与HR坏死程度成正相关。实验结果表明蛋白酶抑制子催化活性位点Arg(99)Ala是关键氨基酸。ACEP60不仅在Cf介导的HR中扮演重要的作用，且在其它类型的HR中也具有相似的功能。.3.尝试性地开展了诱捕ACEP60靶蛋白的工作。.4.建立了高通量筛选烟草和拟南芥方法，利用该方法，可以方便、迅速的有效筛选转基因植株后代。.发表论文3篇，授权专利1项，提交专利1项。毕业硕士2名，在读硕士的2名