水通道蛋白在芽孢萌发途径中介导水分运输的作用机制研究

The sterilization of spore still is a problem in the food processing for their strong resistance. It’s an effective way of inducing spore germination homogenously before killing them. So the study on germination mechanism of spore is of great significance, including water transport involved in the germination of spore, but it remains vague. Aquaporins (AQP) are channel proteins in the membranes, where they facilitate the transcellular movement of water. In our previous study, we analyzed the function of aquaglyceroporin GlpF in spore germination, and the result of germination assay show that spore of mutant germinated more slowly than wild-type. Hence, the key scientific issue of this project is the mechanism of aquaporins in spore germination. In this study, Bacillus subtilis is used as the research object. We will clarify the effect of GlpF to water transport in the germination of spore, identify the new aquaporin and testify its function, and analyze the effect of HPP to aquaporin. All these will discover the molecular mechanism of aquaporin in the germination of spore, and provide the theoretical foundation for improving the technology of sterilization by HHP.

芽孢因具有极端的抗性而成为食品杀菌中面临的难题。诱导其萌发再杀灭成为一条有效的杀灭方式，因而芽孢的萌发机制研究具有重要意义。水是芽孢萌发的关键因子，但其作用机制还不太清楚。水通道蛋白是一类广泛存在于生物膜上的介导水分子运输的通道蛋白。本课题组的前期研究中，分析了枯草芽孢杆菌水-甘油转运蛋白GlpF对芽孢萌发的影响，结果显示，与野生型相比，其突变体芽孢萌发缓慢。因此，拟提出的科学问题是水通道蛋白在芽孢萌发途径中介导水分运输的作用机制。本研究以枯草芽孢杆菌为对象，分析水-甘油转运蛋白GlpF对芽孢萌发中水分运输的作用机制，鉴定新的水通道蛋白，利用超高压验证水通道蛋白转运水的作用机制。这将揭示芽孢萌发中水通道蛋白介导水分运输的作用机制，为阐明芽孢萌发的分子机制提供理论基础，也为超高压杀灭芽孢的技术创新提供依据。

在食品加工和保存过程中，细菌芽孢易萌发并引起食品腐败，因此芽孢的萌发机制研究对其杀灭具有重要意义，而目前对于芽孢萌发中水的进出只有初步研究。GlpF蛋白是一类水通道蛋白，在微生物细胞膜上负责甘油和水分子的转运。本项目以Bacillus subtilis PY79为研究对象，构建了glpF基因缺陷型、超表达和荧光标记菌株，对基因缺陷性菌株的生长能力、生孢能力和其芽孢的抗性变化进行了研究，发现glpF基因的缺失使得枯草芽孢杆菌更早进入平稳期和衰亡期，生长能力降低；缺陷型菌株培养28小时形成芽孢率较野生型低20%，芽孢数量上少1.2个对数，其生孢能力明显降低。同时glpF缺失降低了芽孢内膜稳定性，使得芽孢对于热处理的抗性稍微降低；对高渗环境更加敏感，B. subtilis glpF::kan芽孢在1.5M NaCl条件下存活率为8.4%。进一步研究了B. subtilis glpF::kan芽孢萌发特性的变化。B. subtilis glpF::kan芽孢对于L-alanine、L-valine、AGFK诱导的芽孢萌发响应降低，与野生型相比分别低24%、14%和21%，萌发效果上，L-alanine > L-valine > AGFK；利用200 MPa高静压诱导芽孢萌发，B. subtilis glpF::kan芽孢DPA释放量较野生型低27%；glpF基因的缺失抑制芽孢内膜受体激活萌发通路。B. subtilis glpF::kan芽孢对于DDA、CaDPA和600 MPa高静压诱导的芽孢萌发响应无明显变化，glpF基因的缺失对于芽孢SpoVA蛋白通道和CwIJ激活的萌发通路无显著影响；这表明glpF基因编码的蛋白可能在萌发过程中CaDPA释放阶段有关，此阶段水分子大量进入芽孢核。最后研究了glpF在芽孢萌发中转运水的能力。发现B. subtilis glpF::kan芽孢在萌发过程中对水分活度变化更敏感，在不同水分活度下，B. subtilis glpF::kan芽孢萌发率最大值均低于野生型，并且与野生型相比，突变体菌株能使更少的氘分子被运出体外，说明glpF基因的缺失使得芽孢利用体系中自由水能力降低，GlpF蛋白与芽孢萌发过程中水分子转运过程有关。这些结果可以进一步解释芽孢萌发过程中水分子进出的作用机制，为促进“先萌发后杀灭”杀菌技术应用提供理论指导。