电镜单颗粒技术解析全长尿素酰胺水解酶的分子构架及构象变化机制

Urea amidolyase (UA), a member of the biotin-dependent carboxylase family, plays an important role in recycling nitrogen by catalyzing the conversion of urea to ammonium. The conversion procedure performs consecutively at the C-terminal biotin carboxylase (BC), carboxyltransferase (CT) and the N-terminal allophanate hydrolase domain, respectively corresponding to carboxylating biotin, transferring the carboxyl to urea and hydrolyzing the intermediate product into ammonium. The whole process needs tight communications between individual domains for transferring the substrate/product of related catalytic activities. However interestingly, the other members included in the family have to function as oligomers, while it’s not necessary for UA to be active. Although each terminus of the sequence has been crystalized, the C-terminus’ only captured the CT-BCCP interaction state, which makes the overall molecular architecture of the full-length UA still unavailable hence the mechanism of long-term conformational change in mediating communications between individual domains remains unclear. Here in this proposed project, we attempt to determine the architecture of full-length UA, and uncover the mechanism of long-term conformational change by comparing 3D models resolved by single-particle electron microscopy at different functional states and by related biochemical experiments.

尿素酰胺水解酶（Urea amidolyase, UA）属于生物素依赖的羧化酶家族，能够将尿素转化为氨，在氮元素循环中发挥重要作用。在UA进行尿素转化时，需要其C端生物素羧化酶（BC）、羧基转移酶（CT）及N端脲水解酶（AH）结构域间的紧密协同，以实现底物/产物的顺序传递和与相应酶活的联动，从而依次完成生物素羧化、羧基转移至尿素、脲水解等步骤。有意思的是，虽然同家族的其他成员均通过寡聚体的形式来完成对底物的羧化，但UA的酶活不依赖于寡聚。虽然尿素羧化酶（UC）与AH结构域各自的晶体结构已知，但前者仅捕捉到拟羧基转移状态的构象，因而其整体构架及工作过程中介导结构域间通讯的长程构象变化还不清楚。本项目拟通过电镜单颗粒三维重构技术，解析UA全酶分子构架及不同功能态的构象，结合生化检测手段及构建突变体的酶活检测，揭示其酶活的长程构象变化机制。

尿素酰胺水解酶（UA）是广泛分布于细菌、真菌、藻类及植物中的一种双功能蛋白酶，主要分解尿素，以完成氮元素在生物圈中的循环。该酶的C端为尿素羧化酶结构域（UC），可结合尿素并将其羧化为中间产物脲基甲酸盐，后者经过N端的脲基甲酸盐水解酶结构域（AH）最终分解为氨及二氧化碳。尽管我们前期的实验结果显示，乳酸酵母UA（KlUA）以同源二聚体的形式更为高效地发挥酶活，但仍未解析得到全长KlUA的结构。因此，对于生物素羧基载体蛋白（BCCP）结构域如何在UC结构域内部位移仍不清楚。本项目运用负染单颗粒电镜技术解析了全长KlUA以二聚体形式在三个不同功能状态下的三维结构。有趣的是，我们发现KlUA在结合ADP后，无论是否结合底物尿素，均可重构得到一种构象状态——在形成二聚体的两个单体中，BCCP分别停留在生物素羧化酶（BC）结构域和羧基转移酶（CT）结构域，而在APO状态中却未看到这种构象状态。这种可能的协同机制可以解释KlUA以同源二聚体的形式会发挥更高效的酶活。同时，这种结构的异质性也是我们前期对于全长KlUA的结晶尝试失败的原因。基于得到的实验数据，我们得出的结论是，KlUA-BCCP结构域更可能以一种自发而交替的方式在BC与CT结构域之间位移。这也为生物素依赖的羧化酶家族的BCCP摆动模型的提供了实验依据。