白桦糖基转移酶基因BpGT14在细胞壁发育中的功能研究

Glycosyltransferases (GTs) are one of the largest enzyme groups required for the synthesis of complex wall polysaccharides and glycoproteins in plants. However, due to the limited number of related mutants that have observable phenotypes, the biological function(s) of most GTs in cell-wall biosynthesis and assembly have remained elusive.We haved obtained a mutant, which show pleiotropic phenotypes, including brittleness of the plant body and retarded growth. The gt14 mutant showed impaired cellulose biosynthesis.The gene was cloned and named as BpGT14,which encodes a protein that contains high sequence similarity with glycosyltransferase 14 family. We selected the gt14 mutant and transgenic complementary plants, BpGT14 over expression plant and wild type birch as materials. Based on the stem and root cross-sectioning microscopy and submicroscopic structure and breaking force, the function of BpGT14 in cell wall structure and stem development will be analyzed. We study the effect of BpGT14 gene on the synthesis and distribution of cell wall polysaccharides and glycoproteins and reveal the glycosyltransferase activity. Screening BpGT14 upstream regulatory proteins and GT14-interacting proteins, combined with the RNA in situ hybridization, the study can clarify the expression pattern of BpGT14 gene. Based on the above research, the study could reveal the function of BpGT14 in cell wall biosynthesis and assembly of birch and its effect on birch stems and root development. The study lay the foundation for the transformation of the cell wall and wood formation and directed use of biomass energy.

糖基转移酶(GT)是植物细胞壁多聚糖和糖蛋白合成的关键酶。前期的转基因白桦研究获得一个茎干发育畸形、纤维素含量较低的突变体。T-DNA插入失活基因（命名BpGT14）具有植物GT14家族的保守结构域。该家族基因在细胞壁生物合成中的具体功能还不明确。以gt14突变体及转基因互补植株、BpGT14过表达植株和野生型四种基因型为材料，采用显微及亚显微结构观察和茎干机械强度测试等方法解析BpGT14在细胞壁结构、组成及茎干发育中的功能。研究该基因对细胞壁中多糖和糖蛋白合成及分布的影响,明确该糖基转移酶活性及修饰底物。筛选BpGT14上游调控蛋白及与GT14相互作用的蛋白，结合RNA原位杂交阐明该基因的表达调控模式,并解析其在组培生根过程中的作用机制。通过以上研究明确BpGT14在白桦细胞壁生物合成和组装中的功能及其对茎干和根系发育的影响，为定向改造细胞壁组成、木材特性和生物质能源定向利用奠定基础。

本研究克隆了白桦GT14基因全长序列，命名为BpGT14基因（JQ409354），编码433个氨基酸，含有乙酰葡糖胺基转移酶结构域，其属于一种糖基转移酶14家族的重要结构域。该基因的表达具有部位及时间特异性，其在木质部、韧皮部及叶片中的表达量较高，而在雄花序中表达量较低。非生物胁迫处理结果显示，BpGT14基因对不同处理均产生响应。SA、CdCl2及低温处理结果显示，处理初期（6h）目的基因上调表达，6h处理时分别达到了对照组的51.2、48.9及3.3倍，24h后相对表达量与对照组相比均下调。.以SiteFinding-PCR方法克隆BpGT14基因启动子序列（2169 bp）。利用PLACE在线分析,该启动子除含有转录必备的TATA box、CAAT box等元件外，还含有多种逆境及激素响应元件。同时含有GA及ABA等激素响应元件,还含有两个苯丙烷及木质素生物合成的MYB类转录因子的重要结合元件。构建pBpGT14∷GUS表达载体转化烟草植株，结果表明该启动子在茎段处具有高启动活性。BpGT14基因启动子对ABA，NaCl及PEG处理后的烟草植株中，启动子活性在超过半数时间点上调明显，且对于NaCl及PEG处理响应迅速。本研究选择植物MYBPLANT元件，采用酵母单杂交的方法分析与其互作的调节蛋白。通过酵母单杂交筛选得到了多个互作候选蛋白，从中选出了四个与MYBPLANT互作的蛋白，分别为蛋白糖基化转录因子，生长素响应转录因子，PHD蛋白及DUF4050功能未知蛋白，。.分别构建了白桦BpGT14基因的pBI121植物表达载体及RNA干扰载体。利用农杆菌叶盘转化法，获得转基因白桦组培苗。提取干扰转基因白桦无性系总RNA，表明目标基因BpGT4的表达量都有明显下降，干扰效率达到40%~84%。BpGT14干扰后转基因白桦茎段木质部面积增加23%~47%，而韧皮部面积无明显变化；进一步分析发现，转基因白桦木质部导管横截面积增加了53%~183%,也证实了导管面积的增加是木质部面积增加的部分原因，而韧皮纤维的面积变化不显著。转基因茎段木质部细胞数目变化不明显，但是木质部细胞面积比例有所增加，为对照的1.35~1.51倍。BpGT14表达量的降低使得白桦组培苗的生根能力增强，特别是高盐环境下仍有较高生根能力,说明白桦中蛋白糖基化修饰可能与逆境下适应有关，特别是生根能力。