调控海马神经干细胞微环境EphrinA5/EphA4通路干预癫痫发生发展的机制研究

新生神经元的异常增生与整合是难治性癫痫慢性期自发性痫性发作的重要病生基础; 而癫痫后神经干细胞微环境的可塑性改变对新生神经元的异常增生起着决定性调控作用。新近研究发现ephrinA5/EphA4通路对成年海马神经干细胞微环境稳态的维持至关重要。本项目拟利用逆转录病毒pLXSN-EGFP转染标记颞叶癫痫小鼠模型海马的多能神经干细胞（NPC），通过ephrinA5-Fc/EphA4-Fc干预SGZ中的ephrinA5/EphA4通路，观察其神经干细胞微环境中微血管结构、胶质细胞激活、细胞因子释放等改变，探究ephrinA5/EphA4调控TrkB/PI-3K/Akt通路发挥效应的可能机制；应用激光共聚焦显微镜和膜片钳检测干预对癫痫后NPC异常增生与整合的影响；利用siRNA技术在体外实验进一步探讨ephrinA5/EphA4与TrkB通路的相互作用机制；进而为难治性癫痫的治疗提供新的突破点。

本实验通过成功构建匹罗卡品致痫后自发性癫痫发作C57BL/6成年小鼠模型，观察到癫痫后ephrin-A5和EphA4蛋白均可在小鼠海马齿状回颗粒细胞层（GCL）、CA1和CA3区锥体细胞层（PCL）、门区、颗粒细胞下层等部位的细胞胞体表达。进一步共定位分析发现ephrin-A5蛋白可表达于小鼠海马的星形胶质细胞，EphA4蛋白可表达于PECAM-1标记的微血管表面。并且在致痫后7天至56天，小鼠海马区ephrin-A5和EphA4分子在转录水平、翻译水平出现动态地表达变化，其mRNA拷贝数及蛋白表达水平均呈现随癫痫时间延长逐渐上升，到28天表达达到高峰，56天时表达稍有下降。ephrin-A5和EphA4两种蛋白的结合力也出现变化，提示ephrin-A5/EphA4通路可能参与癫痫发生发展的过程中。同时也发现癫痫后小鼠海马齿状回门区、CA1和CA3区PECAM-1标记的微血管管径和分布密度增加，微血管走形紊乱，分支增多，形成异常的血管丛。随后我们在实验中成功的逆病毒转录海马神经干细胞，但由于转染率不高，于是我们创新性的利用微量渗透泵注射技术向致痫后小鼠海马立体定向局部精准注射ephrin-A5-Fc融合蛋白，发现小鼠自发性痫性发作频率、发作强度和发作行为学评分均下降，小鼠海马门区神经干细胞向前体细胞分化能力下降，门区、CA1和CA3区微血管管径缩小、分布密度下降、血管走形较规整、分支减少。此外， 我们进一步对其分子机制进行深入探讨，发现EphA4蛋白表达下降，其下游信号通路蛋白p-Akt、p-ERK以及共同的下游分子蛋白VEGF表达均下降，提示Akt和ERK通路可能均参与到ephrin-A5/EphA4通路调控癫痫发生发展的机制中。同时，我们在课题的研究过程中根据研究的数据对实验进行了进一步的扩展，将EphB家族对癫痫新生神经元的影响亦进行了深入的了解。受本课题资助，培养博士研究生1名、硕士研究生2名，并在国内外重要学术期刊和学术会议上发表论文共7篇，其中SCI英文 6篇 （均标注基金资助， 文章最高影响因子5.28），美国神经科年会会议报告1篇。