转Bt+CpTI基因抗虫棉对土壤氮素代谢微生物多样性的影响

转基因植物的大面积种植, 为人们带来巨大经济效益的同时, 也加剧了人们对转基因植物潜在生态风险的担忧。目前，转基因植物风险评价中对生物多样性影响主要集中在对非目标动植物多样性的影响，而转基因植物对土壤微生物影响还未引起足够的重视。转Bt+CpTI基因抗虫棉是我国种植面积最广的转基因作物，转基因棉花对土壤微生物的影响研究多集中在对整体微生物群落的关注，对功能微生物尤其是对参与营养循环微生物的研究甚少。本项目采用变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）、末端标记限制性多态性分析（PCR-T-RFLP）技术和实时荧光定量PCR方法结合土壤酶活测定，从群落组成、数量和活性上研究转Bt+CpTI基因棉对土壤中氮素代谢功能微生物（氨氧化菌、硝化细菌和反硝化细菌）的影响。通过生态统计分析软件剖析转基因棉花对微生物群落多样性的影响，以期为转基因植物生态风险评价体系的建立提供依据。

转基因棉花对土壤微生物的影响是转基因棉花生态安全评价的一个重要组成部分。课题主要针对转Bt+CpTI 基因棉花及其受体棉花，在两种的棉花不同生长时期取根际土壤进行研究：选取土壤中的氮素循环的功能微生物包括氨氧化细菌、氨氧化古菌和反硝化细菌为指示性微生物，采用定量PCR和末端标记限制性片段多态性方法对其进行丰度和多样性变化研究，同时结合土壤中氮素转化和土壤酶活，通过典范和部分典范相关分析深度剖析了氮素转化微生物与转基因棉花、环境因素之间的关系。. 构建了可用于氨氧化细菌、氨氧化古菌功能基因amoA，反硝化细菌功能基因nirS和nosZ定量的标准质粒分子pNIM-005，采用微滴数字PCR和同位素稀释质谱方法（IDMS）对该标准物质进行了定值。利用该质粒分子作为标准，通过实时荧光定量PCR方法研究了转基因棉花和非转基因棉花根际土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌的丰度，结果发现转基因棉花对氨氧化细菌和古菌的影响结果类似，均表现为与非转基因棉花相比，转基因棉花根际土壤中的氨氧化细菌和氨氧化古菌变化趋势比较平缓。. 研究并建立了细菌16S rRNA和氨氧化细菌amoA基因的微滴数字PCR定量分析方法，并且通过该方法揭示了转Bt+CpTI 基因棉花和非转基因棉花根际土壤中细菌丰度变化和氨氧化细菌丰度变化，结果发现：两种棉花根际土壤中的总细菌数量没有显著变化，而氨氧化细菌变化趋势显著不同，转Bt+CpTI 基因棉花根际土壤中氨氧化细菌变化趋势与非转基因棉花相比比较平缓。 采用末端标记限制性片段多态性分析技术（T-RFLP）研究分析了转基因棉花和非转基因棉花根际土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌的群落结构，发现氨氧化细菌群落结构受棉花品种和棉花生长周期的影响，而氨氧化古菌群落结构受棉花品种影响最显著，转Bt+CpTI 基因棉花根际土壤中氨氧化古菌的群落多样性显著高于非转基因棉花根际土壤中氨氧化古菌的群落多样性。 对反硝化细菌的丰度分析发现：与转基因棉花相比，非转基因棉花根际土壤中反硝化细菌的丰度变化受棉花生长周期影响更显著。典范和部分典范相关相关分析其群落结构发现，除了pH、硝酸根浓度、蕾期和花期外，棉花品种即转基因棉花与非转基因棉花的种植对反硝化细菌的多样性影响最为显著，且两者的影响作用呈相反趋势。反硝化细菌的丰度和多样性既受棉花生长时期的影响，同时也受棉花品种的影响。