不结球白菜耐寒关键基因的鉴定、分析及功能研究

The low temperature is an important factor limiting crop yield and quality. Non-heading Chinese cabbage is one of the important vegetable crops in China. But low temperatures and even freezing temperatures often affect its yield and quality. Based on the 1,986 germplasm resources of five variants of non- heading Chinese cabbage, we have resequenced 102 key germplasms of non-heading Chinese cabbage (24 cold-resistant cultivars) and cloned 3 cold-resistant genes from the cultivar that can survive at -9.7℃ environment. In this study we will screen out key cold-resistant genes or genetics sites using GWAS (Genome-wide Association Study) after reduced-representation sequencing database of cold-resistant and non-cold-resistant non-heading Chinese cabbage. Then we will analyze their gene structure, and gene transcription and expression profiling to explore regulation network of cold-resistance by RNA sequencing, two yeast hybrid, protein and chromatin co-immunoprecipitation. Furthermore, we will verify the function of cold-resistant genes by gene overexpression, VIGS and TILLING. The genetics study methods of cold-resistant genes with bioinformatics will be helpful to molecular breeding for cold-resistant non-heading Chinese cabbage or other crops.

低温是限制作物产量和品质的一个重要因素。不结球白菜是我国重要的蔬菜作物之一，但经常遭受低温甚至冻害的影响，使其产量和品质下降。本研究在拥有不结球白菜五个变种1986份资源的基础上，已完成102份材料的重测序（其中耐寒资源24份），还从耐-9.7℃的材料中克隆到了3个耐寒基因（BrICE1、BrCBF和BrCOR14）；拟通过对不结球白菜耐寒资源和不耐寒资源进行简化基因组测序，利用全基因组关联分析方法，发掘耐寒基因，并对其编码的蛋白质进行生物信息学分析。利用转录组测序、酵母双杂交、蛋白质免疫共沉淀和染色质免疫共沉淀等技术，研究耐寒基因及转录因子间的互作机理以及调控通路网络。然后利用基因过量表达、TILLING、VIGS等技术对抗寒相关基因进行系统的功能验证，最终确定耐寒关键基因。本研究探索出的耐寒基因遗传研究方法，可为不结球白菜乃至其它作物耐寒新品种的选育提供理论依据和技术手段。

低温对不结球白菜种子生产及冬春季栽培生产具有重要影响。在新品种培育方面，除了高产、优质和抗病之外，对耐寒的专用型不结球白菜也提出了新的要求。因此，发掘不结球白菜耐寒基因，通过分子生物学手段加以调控和利用，对不结球白菜的抗寒育种研究具有重要意义。针对不结球白菜生产中存在耐寒品种较少的突出问题，开展了以下研究：1）对102份不结球白菜试验材料分别从基因型和表型进行耐寒性状分析，利用相关的表型数据和测序所得到的SNP数据，采用全基因组关联分析（GWAS）的方法对102份不结球白菜耐寒基因进行定位。2）利用TASSEL软件提供的GLM、MLM模型对SNP数据进行显著性分析。通过MLM模型，找到显著性的SNP位点1个，GO注释等发现有一个候选基因Bra017117与拟南芥胁迫响应转录因子家族成员WRKY33高度同源；通过GLM模型，找到显著性的SNP位点3个。3）对白菜类作物CBF基因的启动子顺式元件进行分析，结果显示其都含有MYB结合元件，表明MYB转录因子在白菜类作物CBF上游调控中具有普遍性作用。4）验证了BrWRKY33蛋白可以特异性的与BrCBF3启动子结合，即BrWRKY33可以调控下游BrCBF3基因的表达，从而响应低温信号并作出应答。5）利用转录组测序技术，研究了耐寒基因及转录因子间的互作机理以及调控通路网络。发现了两个冷调控基因（CabbageG_a_f_g014059和Cabbage G_a_f_g014057），低温、PEG和ABA能够交互影响这些基因的表达。6）对耐寒相关基因家族（R2R3-MYB、SnRK、BES1、CDPK-SnRK、MAPK和BcHHP）进行了全基因组功能分析。研究了这些家族基因在不同组织中的表达和对非生物胁迫的响应，证明它们在白菜抗寒及生长发育中发挥着重要的作用。这些研究成果为深入解析不结球白菜耐寒遗传调控机制奠定了重要的理论基础。在项目实施过程中，发表SCI论文22篇，其中，第一标注SCI论文14篇；申请国家发明专利8件。获得教育部高等学校科学研究优秀成果奖自然科学奖二等奖1项，教育部高等学校科学研究优秀成果奖技术发明奖二等奖1项，培养博士研究生5名，硕士研究生3名；项目负责人担任第三届国际园艺研究大会主席。