具核梭杆菌通过代谢产物L-精氨酸促进结直肠癌侵袭和转移的机制研究

Recent studies have suggested gut microbiota play a crucial role in the occurrence and development of colorectal cancer (CRC). Previously, we have proved that both Fusobacterium nucleatum (Fn) and its cultural supernatant can promote the invasion and migration of CRC cells, and also found L-arginine was significantly increased in its cultural supernatant as compared with normal culture medium, and could upregulate the expression of c-Myb and c-fos in CRC cells. Therefore, we speculate L-arginine may be the oncogenic metabolite of Fn, and hypothesize that it induces the epithelial-mesenchymal transition in CRC cells through regulating NO-c-Myb-c-fos signaling pathway, contributing to the Fn induced CRC invasion and migration. In this study, we aim to validate this scientific hypothesis using clinical samples as well as in vitro and in vivo assays such as metabonomic/transcriptomic technique, in vivo metastasis model, CRISPR/Cas9 gene editing and Chromatin Immunoprecipitation. Based on this study, we will investigate the mechanism of the L-arginine mediated driving role of Fn in CRC invasion and metastasis, and try to discover potential therapeutical targets. This study will provide theoretical foundation for better understanding about the metabolites induced oncogenic role of gut microbiota in CRC development and establishing related therapeutical strategies.

近年来研究发现肠道菌群在结直肠癌（CRC）发生发展中扮演着重要角色。我们前期证实具核梭杆菌（Fn）及其培养上清均能够促进CRC细胞的侵袭和转移能力，同时发现L-精氨酸在Fn培养上清中的含量相对于正常培养基显著升高，并且其能够上调CRC细胞中c-Myb及c-fos表达水平。因而，我们推测L-精氨酸可能为Fn的促癌代谢产物，其促癌机制可能为L-精氨酸通过调控NO-c-Myb-c-fos信号通路诱导CRC细胞发生上皮细胞间质转化，从而介导Fn诱导的CRC侵袭和转移。本项目中，我们拟在临床样本和体内外实验中通过代谢组学/转录组学技术、体内转移模型、CRISPR/Cas9基因编辑技术、免疫共沉淀等手段验证上述科学假设，探讨Fn通过代谢产物L-精氨酸促CRC侵袭和转移的分子机制并寻找潜在干预靶点。本研究可为我们深入理解肠道菌群通过代谢产物促CRC发展的机理并研发相关治疗策略提供理论基础。

最新研究表明肠道菌群及其关联代谢产物在结直肠癌（CRC）发生发展过程中扮演着重要角色。本项目聚焦具核梭杆菌（Fn）在CRC中的促癌分子机制开展如下研究：1）我们首先发现Fn的培养上清能够促进CRC细胞增殖及迁移能力。随后我们通过代谢组学技术发现L-精氨酸可能为Fn的促癌代谢产物之一。临床样本验证发现CRC患者血清中的L-精氨酸含量显著高于正常健康对照。功能研究表明L-精氨酸促癌效应在其浓度为100nm时最为显著。最后，基于转录组测序的机制研究发现L-精氨酸上调CRC细胞中的c-Myb表达水平，进而促进下游c-fos的转录，最终介导CRC细胞发生上皮细胞间质转化（EMT）。2）我们首先利用代谢组学技术在CRC患者和健康人群的血清样本中筛选差异代谢产物，结果表明EpOME含量在CRC患者血清中显著升高并在肠癌小鼠模型中得到验证。随后，体内外功能实验表明EpOME及其调控代谢基因CYP2J2均能够促进CRC细胞的侵袭、转移及EMT。同时，CYP2J2过表达联合亚油酸饮食能够促进小鼠肠道的肿瘤形成。我们通过宏基因组学技术发现CRC患者血清EpOME含量与粪便Fn丰度呈正相关。在训练队列和验证队列中，CRC组织中Fn丰度与CYP2J2表达水平呈正相关。CRC细胞中CYP2J2敲低能够拮抗Fn介导的CRC细胞侵袭、迁移及EMT。此外，在CYP2J5敲除的无菌小鼠中予以Fn灌胃及致癌诱导后发现，Fn在小鼠肠道的促癌效应明显受到抑制。最后，基于转录组测序的机制研究发现Fn激活TLR4/AKT/Keap1/Nrf2信号通路促进CRC细胞中CYP2J2转录，最终上调其表达水平并促进EpOME产生。3）我们通过蛋白质组学技术发现Fn能够上调整合素α5（ITGA5）的表达水平，同时在CRC组织中发现Fn丰度与ITGA5表达水平呈正相关。随后，机制研究发现Fn能够激活E-cadherin/KLF4信号级联上调ITGA5表达水平，最终增强CRC细胞的恶性潜能。本项目通过临床样本检测及生物学实验进一步阐明Fn通过关联代谢产物促CRC发生发展的分子机制，为基于肠道菌群的新型抗癌策略提供理论基础。