以共微囊化细胞为“致孔剂”在超临界流体中构建组织工程肝组织

传统方法构建组织工程组织或器官一般先加入致孔剂制备多孔支架材料后，再与种子细胞共培养，该法存在制备过程难于复合生物活性物质及种子细胞难以长入支架内部的缺点。本项目拟结合超临界流体技术和共微囊化细胞技术两者的优点，利用微囊化对细胞的保护隔离作用，直接将共微囊化干/肝细胞作为"致孔剂"预先与聚合物材料混合均匀，然后经超临界流体技术处理后在支架材料内部的微胶囊之间形成相互贯通的微孔结构，最后利用破囊液除去微胶囊保护层，释放出囊内包埋的细胞贴附在内表面具有微观粗糙纳米纤维结构的支架上进行培养，构建组织工程肝组织。该方式解决了细胞在支架上培养时无法进入支架内部、细胞营养物质供应不足而影响组织形成的问题；同时也解决了致孔剂滤沥导致活性生长因子流失的问题。本项目一旦成功，有望为组织工程再生医学的研究提供一种新思路。

首先，采用高压静电法制备载BMSCs细胞的ACA微胶囊，优化制备工艺为：两步法制备，海藻酸钠浓度1.75%（w/v），成膜时间10 min，细胞密度1×106个/mL。制出的载BMSCs微囊球形度好、表面光滑，粒径主要分布在300~400 μm间且7天内随时间变化不大，机械强度较好且囊内细胞分布均匀、活性高，破囊后重新培养的BMSCs细胞生长良好。.其次，采用平板、微囊化、共培养及共微囊化四种培养方式来培养肝细胞以白蛋白及尿素分泌量为检测指标考察比较肝细胞的代谢性能。结果表明，四组分泌白蛋白量及尿素的大小关系均为：共微囊化BMSCs/肝细胞组> BMSCs/肝细胞组>微囊化肝细胞组> 肝细胞细胞组。实验结果表明微胶囊可以为骨髓间充质干细胞诱导分化成成体细胞提供微环境，共微囊化骨髓间充质干细胞和肝细胞用于组织工程具有潜在应用前景。.再次，通过复乳法制备PLGA多孔微球。实验结果表明，均质匀化速率为10,000 rpm，外水相与油相体积比为1:3.2，PLGA浓度为6%，发泡剂浓度为10%，搅拌速率为200 rpm，PVA浓度为0.5%的条件下，可制备出平均孔径大于20 μm，粒径大于200 μm且吸水率良好的多孔微球，基本无有机溶剂残留。.然后，以多孔微球为基元，采用亚临界二氧化碳进行烧结。实验结果表明，粒径为200~350 μm，烧结压力为2 MPa，烧结时间为10 min的条件下，可制备出微球平均泡孔大于20 μm，压缩强度高（>100 kPa），孔隙率高（>85%）的烧结支架。理化性质未发生明显变化。生物相容性评价结果表明PLGA微球支架无毒，血液相容性好；亚临界CO2对细胞生理活性无明显影响。.最后，分别制备共载C5.18与L929两种细胞的多孔微球烧结支架，研究细胞在支架上的生理活性。实验结果表明，一步法构建共载细胞多孔微球烧结支架，可以提高细胞在支架上的黏附率，同时较大的孔径不仅为细胞提供黏附位点，而且利于成纤维细胞向微球内部生长，细胞持续增殖21天。蛋白分泌实验结果表明，细胞分泌蛋白能力未受亚临界CO2影响。.总之，通过一步法制备共载细胞多孔微球烧结支架，不仅保证细胞在高压环境下的活性，同时避免有机溶剂残留、生物活性物质失活等问题。该“模块化”组织工程构建法为组织工程研究提供了新的方法。