六味地黄丸对肿瘤自杀基因治疗增效作用的物质基础研究

自杀基因疗法由于存在旁杀伤效应的独特机制而成为最具临床应用前景的肿瘤治疗新方法。增强旁杀伤效应是自杀基因治疗增效的主要措施之一。前期两项国家自然科学基金课题研究结果表明：六味地黄丸对小鼠移植性肝癌和黑色素瘤的自杀基因治疗具有增效作用，并能改善肿瘤自杀基因治疗的免疫微环境；体外实验显示该方含药血清能增强自杀基因对肿瘤细胞的杀伤效应，其增效作用与旁杀伤效应的"缝隙连接"机制相关。虽然前期工作已证明六味地黄丸可通过增强肿瘤自杀基因疗法旁杀伤效应对肿瘤自杀基因疗法起到肯定的的增效作用，但其药效物质基础仍未明确。本课题拟采用六味地黄丸血清药物化学研究最新成果，探讨六味地黄丸血中主要移行成分对肿瘤自杀基因治疗增效作用，筛选出何种或哪些血中移行成分对肿瘤自杀基因治疗具有增效作用，并探讨其增效机制。通过研究阐明六味地黄丸增效肿瘤自杀基因疗法的物质基础。

在前两项国家自然科学基金项目研究结果表明六味地黄丸对肿瘤自杀基因治疗增效的基础上，本项目对增效作用的物质基础进行了研究。研究了血清药物化学（假说：中药复方作用的物质基础为入血成分）分离到的六味地黄丸五种主要入血成分：5-羟甲基-2-糠酸、莫诺苷、獐牙菜苷、马钱子苷、丹皮酚。预期研究目标为明确六味地黄丸入血成分中何种或哪几种化合物具有增效作用，并阐明其对肿瘤自杀基因治疗增效作用的初步机制。为了达到上述研究目标，我们建立了黑色素瘤及肝细胞癌肿瘤自杀基因治疗模型，在细胞水平和动物水平进行了研究。研究结果表明六味地黄丸五种入血成分混合组分在动物水平，能增强自杀基因治疗系统对小鼠移植瘤生长的抑制效应。而体外实验结果与预期有所不同，将五种入血成分及混合组分与肿瘤自杀基因治疗系统联合应用，未能显示出对自杀基因系统杀伤肿瘤细胞的直接增效作用。有文献报导免疫活性物质（如淋巴因子、激素及神经递质等）能影响细胞缝隙连接通讯功能。六味地黄丸作为免疫调节药物，其增效作用是否与免疫有关？本研究将六味地黄丸五种入血成分混合组分与脾淋巴细胞共同培养制成含药淋巴上清，并作用于自杀基因治疗系统，实验结果显示：含药淋巴上清确实能增强自杀基因治疗系统对肿瘤细胞的杀伤效应；进一步的机制研究显示含药淋巴细胞培养上清能改善肿瘤细胞GJ功能；但对基因治疗杀伤敏感性影响不明显。说明增效作用主要为旁杀伤效应的“缝隙连接” 机制。鉴于上述五种入血成分未能显示出明显的直接增效作用。我们开展了拓展研究，筛选到了六味地黄丸组方中山药的活性成分薯蓣皂苷能通过增强自杀基因旁杀效应的“缝隙连接机制”发挥直接的增效作用。.项目还根据后继研究需要进行了其他方面的拓展：（1）为了更直观地显示肿瘤细胞的自杀与旁杀伤效应，构建了带绿色荧光蛋白与带红色荧光蛋白的TK阳性细胞和TK阴性细胞可视化的B16黑色素瘤细胞基因治疗系统。（2）构建了Cx表达筛选平台，用于药物促进Cx表达的快速筛选；（3）为了克服阳性对照药物和阴性对照药物作用的不稳定性，构建了过表达Cx43和Cx43突变细胞模型，用于阳性对照和阴性对照。.项目研究根据各阶段结果进行了部分调整，有增有减。总体而言，完成了项目主要的研究内容，证明了六味地黄丸主要入血成分是通过间接的促进内源性活性物质释放（淋巴因子、激素、神经递质等）介导的“免疫”和“缝隙连接”机制发挥增效作用。