基于C5-异构酶-2-O-硫酸基转移酶双功能融合酶的高艾杜糖醛酸含量肝素类似物的人工合成、结构调控及活性评价

Enzymatic Synthesis of heparin is a "hot" spot in Glycobiology field. Current studies found that the L-idopyranosyluronic acid (L-IdoA) content in enzymatic or chemoenzymatic synthesized heparin was much lower than that of natural heparin due to the low conversion efficiency of C5-epimerase (C5-epi) catalyzed epimerization, causing the structure and biological functions gap between synthetic heparin and natural heparin. This work aims to construct C5-epi-2-OST bifunctional fusion enzyme in order to enhance the epimerization activity and increase the IdoA content based on the known intimate synergetic effects of C5-epi and 2-O-sulftransferase (2-OST). The majority of this work includes: i) construction, expression, selection and optimization of C5-epi-2-OST bifunctional fusion enzyme with high epimerization activity; ii) study the molecular mechanism of the enhancement of C5-epi activity by 2-OST fusion; iii) synthesis of high IdoA content Heparin-like molecules and their structure characterization; and iv) study the effects of IdoA content on the overall structure, sulfation pattern as well as biological function of HP.

酶法合成肝素（HP）是糖生物学领域的热点问题。在目前以K5PS为前体酶法或化学-酶法合成HP的研究中，普遍发现C5-异构酶（C5-epi）催化葡萄糖醛酸（GlcA）异构化成艾杜糖醛酸（IdoA）效率低，严重影响后续反应中硫酸基转移酶的催化活性，导致合成HP在结构和功能上与天然肝素存在较大差异。针对这一问题，本项目拟借助2-O-硫酸基转移酶（2-OST）与C5-epi天然协同催化的特性，构建高异构化活性C5-epi-2-OST双功能融合酶，提高C5-epi的催化效率，以合成高IdoA含量HP类似物。项目将主要研究包括：（1）高异构化活性C5-epi-2-OST双功能融合酶的构建策略、筛选和优化；（2）2-OST对C5-epi增强的分子机制探讨；（3）高IdoA含量HP类似物的合成及结构表征；（4）IdoA含量对HP结构和生物活性的影响等。

本项目首先建立了肝素相关合成酶、降解酶以及结构修饰酶的高表达体系。通过在酶的C末端引入可溶性配体SUMO（small ubiquitin-like modifier，小泛素类似修饰蛋白质）构建融合酶，实现了肝素相关酶的可溶性表达。其中，融合酶Sumo-Hep-I无论是产量还是比酶活都得到了较大的提升。其次，进一步对酶的结构进行优化设计，在融合酶C端引入甲壳素结合蛋白，不仅能保证酶的高表达，而且结合甲壳素低温溶解技术制备的甲壳素微球，能一步实现酶的纯化和固定化，为肝素类多糖的大量合成、结构改造提供了重要的手段。由此法制得的融合酶ChBD-Sumo-Hep-I用于制备低分子量肝素，具有成本低、质量稳定、工艺简单等优点，具有产业化的潜力。最后通过化学法-酶法相结合的方法，成功制备了系列不同结构的肝素类似物，研究了其激活巨噬细胞、促进骨髓间充质干细胞的分化以及抑制肿瘤细胞生长分化的生物活性及其作用机制，探讨了多糖结构与其生物活性之间的关系。