TARDBP调节miR-9表达致OPTN（E50K）突变的RGCs凋亡

OPTN is known as a POAG related gene, and it is highly associated with miR-9. In our recent study, we demonstrated that miR-9 was involved in p-CREB-REST pathway regulating the expression of BDNF in OPTN(E50K) mutation induced RGCs apoptosis. However, the mechanism of the decreased miR-9 in OPTN(E50K) mutation is still unclear. Given that OPTN(E50K) mutation could impaire the selective autophagic degradation of TARDBP, and the function of TARDBP is regulating expression of miR-9 via modulating the activity of Drosha and Dicer complexes. We plan to research whether the overexpression or inhibition of TARDBP could alter the degradation of ubiquitinated aggregates of TARDBP, and to demonstrate the interaction between TARDBP and Drosha/Dicer that regulates miR-9 expression and RGCs apoptosis, which could elucidate the mechanism of OPTN gene altering miRNA in POAG and provide a diagnostic molecular marker and a novel therapy to glaucoma.

OPTN基因是原发性开角型青光眼（POAG）相关致病基因，OPTN与miR-9具有极高相关性，申请者前期研究证实OPTN(E50K)突变中miR-9参与p-CREB-REST通路调控BDNF表达致视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡，但OPTN（E50K）突变致miR-9水平下调机制不清。考虑到OPTN（E50K）突变可干扰选择性自噬而影响TARDBP的正常降解、TARDBP蛋白又可调节Drosha和Dicer酶活性改变miR-9表达，本研究拟利用申请者已建立的体内外OPTN（E50K）突变转基因模型，过表达或抑制TARDBP，观察泛素化TARDBP聚合体的自噬降解、TARDBP蛋白与Drosha和Dicer酶的结合情况对miR-9表达和RGCs凋亡的影响，阐明OPTN基因突变对miR-9的调节机制和POAG发病的分子机制，为其将来临床更早期诊断和治疗提供新的分子标志和治疗靶点。

研究背景：OPTN基因是原发性正常眼压性青光眼（NTG）的致病基因。前期实验证实OPTN(E50K)突变中miR-9参与p-CREB-REST通路调控BDNF表达致视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡，但OPTN（E50K）突变致miR-9水平下调机制不清。.研究内容：本课题利用CRISPR/Cas9技术建立OPTN（E50K）基因突变小鼠模型、利用腺病毒建立OPTN（WT）和OPTN（E50K）瞬时转染细胞模型进行实验。应用 real-time PCR检测mir-9及TARDBP的转录水平，应用Western Blot检测OPTN、TARDBP、LC3、p62、caspase3等蛋白的表达水平，应用细胞及组织免疫荧光技术检测各种蛋白在细胞内的定位及表达情况，应用免疫共沉淀技术检测蛋白之间的互作情况，并利用flash-VEP、明暗穿梭实验、OCT、HE染色等手段对小鼠视网膜形态、功能进行检查，对体内外模型RGCs细胞凋亡情况进行分析。.研究结果：在OPTN（E50K）基因突变的体内外模型中均可观察到突变蛋白与LC3及TARDBP的互作关系改变，细胞内LC3-II及P62增多，胞浆内TARDBP聚集体增多，miR-9表达下调，凋亡蛋白caspase3表达水平上调，RGCs凋亡增多，数量减少，小鼠模型发生视功能及视网膜结构异常。.结论与意义：OPTN（E50K）突变蛋白抑制自噬进行，影响TARDBP蛋白代谢，使其在细胞中的分布与功能异常，进而影响miR-9的表达，使mir-9水平降低，增加RGCs凋亡，致青光眼发生，为OPTN基因突变导致NTG的分子生物学机制提供了新的证据，进一步为青光眼的早期诊断及基因治疗提供了良好的研究基础，为临床治疗青光眼提供新的策略和治疗靶点。