泛素连接酶Nedd4l介导细胞自噬调控腭裂发生的作用机制研究

Cleft lip with or without cleft palate is one of the most common born defects. Developing a prevention strategy will efficiently decrease the incidence. To achieve this, we have to explore the precise molecular mechanism in palatogenesis. Ubiquitination affects cellular process by regulating the degradation of proteins, coordinating the cellular localization of proteins, activating and inactivating proteins, and modulating protein-protein interactions. Autophagy is the natural, regulated, destructive mechanism of the cell that disassembles unnecessary or dysfunctional components. Experiments revealed that HECT domain ubiquitin ligase Nedd4l could regulate autophagy, and some mutants of NEDD4L in HECT domain would cause cleft palate. Besides, autophagy was involved in apoptosis, cell migration and epithelial-mesenchymal transition. Based on these results, we assume that during palatogenesis Nedd4l can regulate autophagy via ubiquitination, thus affect the apoptosis, cell migration and epithelial-mesenchymal transition of medium edge epithelial cells, resulting in cleft palate. To verify this, we will generate conditional NEDD4L knockout mice. Then, we will detect the spatial and temporal expression of NEDD4L, and illustrate the interaction between Nedd4l and autophagy in palatogensis, finally explore the underlying mechanism of palatal fusion. After all, we hope to establish a new theory about palate fusion, and provide a new basis for prevention and early diagnosis of cleft palate.

唇腭裂是最常见的出生缺陷之一，但迄今为止仍没有有效的预防措施，归根结底是因为唇腭裂发生的关键机制仍不明确，有待进一步研究。泛素化修饰是蛋白质降解的重要途径之一，而自噬是维持细胞稳态的重要机制。研究发现泛素连接酶Nedd4l能调节自噬，其HECT结构域突变会导致腭裂，且自噬也被证实参与细胞凋亡、迁移和上皮细胞-间充质转化的调控。基于此研究结果，本课题组认为在腭胚突融合过程中，Nedd4l可以通过泛素化作用调节腭中嵴上皮细胞的自噬作用，影响其凋亡、迁移和间充质转化，从而引起腭裂的发生。为验证此假设， 本研究拟采用条件性基因敲除技术，通过对敲除鼠和野生鼠大体样本观察，体外器官培养和细胞培养，采用细胞生物及分子生物学方法，对Nedd4l在腭发育过程中的表达模式进行描述，并发现其对腭胚突细胞自噬的影响，探索其与腭裂发生的相关性及作用机制，从而为腭裂的预防和早期干预提供新的理论依据。

唇腭裂是最常见的出生缺陷之一，但迄今为止仍没有有效的预防措施，归根结底是因为唇腭裂发生的关键机制仍不明确，有待进一步研究。泛素化修饰是蛋白质降解的重要途径之一，而自噬是维持细胞稳态的重要机制。研究发现泛素连接酶Nedd4l能调节自噬，其HECT结构域突变会导致腭裂，且自噬也被证实参与细胞凋亡、迁移和上皮细胞-间充质转化的调控。基于此研究结果，本课题组认为在腭胚突融合过程中，Nedd4l可以通过泛素化作用调节腭中嵴上皮细胞的自噬作用，影响其凋亡、迁移和间充质转化，从而引起腭裂的发生。为验证此假设，本研究拟对Nedd4l在腭发育过程中的表达模式进行描述，并发现其对腭胚突细胞自噬的影响，探索其与腭裂发生的相关性及作用机制，从而为腭裂的预防和早期干预提供新的理论依据。研究描述了Nedd4l 蛋白在腭胚突不同部位的时空表达情况，同时建立了腭胚突体外培养模型并进行方法改进，分离培养上鼠腭胚突上皮细胞，发现Nedd4l蛋白在体外对该细胞自噬水平的影响，敲低Nedd4l自噬水平明显增加，过表达Nedd4l自噬水平下降。研究进这一步提示Nedd4l蛋白可能过影响腭胚突上皮细胞Tgf-β信号通路影响自噬水平，但尚需进一步验证。