多能干细胞特异的逆转座子缺失：发生机制和对基因表达影响的组学研究

Retrotransponson is an essential component in eukaryotic genomes. Transcripts of certain retrotransposons involve in the process underlying early embryonic development and pluripotency maintenance of stem cells in mammals. In addition, retrotransposon is recruited in regulating of gene expression via playing a cis-acting role by its integration into the genome. Unexpectedly, a set of retrotransposons was detected in our recent findings, which specifically and precisely deleted in parts of mouse induced pluripotent stem cells compared with the parental somatic cells, meanwhile introduced a genetic heterogeneity. Experimental evidence indicated the occurrence of such retrotransposon deletions is associated with pluripotency. However, the mechanism of these unique deletions of retrotransposons and the subsequent effects in pluripotent stem cells are unknown. We attempt to propose a research plan including the following two sections: (1) To evaluate the recombination hotspots and epigenomic factors such as DNA methylation and chromatin structure that might lead to the occurrence of deletions of retrotransposons via a association study and RNAi experiments. (2) Via integrated analysis of genome and transcriptome of one single cell, to evaluate the impacts of deletions of retrotransposon on transcriptome in each cell, and thereby to explore the corresponding functions in maintenance of transcriptional heterogeneity and pluripotency in pluripotent stem cells. Through the studies in this plan, we expect to reveal the potential mechanism and biological function of the unique deletions of retrotransposons in pluripotent stem cells.

逆转座子是真核基因组中的重要组成部分，部分逆转座子的转录本参与了哺乳动物早期胚胎发育和干细胞的多能性维持。逆转座子也可插入整合到调控区域，行使顺式调控作用，调节目标区域内基因的表达。我们先前的研究发现，小鼠多能干细胞，相对于分化细胞，在部分细胞中存在特异的逆转座子缺失，造成多能干细胞的遗传异质性，并且这些缺失与分化状态相关。本项目基于先前的研究发现，从如下两个方面展开后续研究：（1）通过断点处序列基序和表观基因组分析，解析此类逆转座子缺失与重组热点、逆转座子活性及染色质结构的相关性，并通过RNAi实验进一步确立染色质结构的改变对缺失发生的影响，从而揭示缺失发生的潜在机制；（2）通过单细胞整合分析技术，解析逆转座子缺失对相关基因表达的影响，从而探究其在多能干细胞表达异质性和多能性维持中作用。期望通过以上研究，揭示多能干细胞中逆转座子缺失的发生机制和生物学功能。

多能干细胞广泛存在异质性，表现在表观组和转录组上在单细胞水平存在显著差异。我们先前的研究发现，在小鼠的iPS 细胞，胚胎干细胞和囊胚细胞中特异存在的逆转座子缺失，并且缺失在不同的细胞中存在异质性。另外，突变基于多能性，在分化细胞和多能干细胞间存在差异。本课题从单细胞组学研究出发，对此类逆转座子缺失对转录组的影响、多能干细胞中逆转座子缺失造成的细胞间异质性与转录组异质性相关性，以及逆转座子缺失在细胞干性维持和发育分化中的作用等生物学问题展开研究。.项目的主要研究内容可以概括为四个部分：小鼠胚胎干细胞中逆转座子缺失的深入挖掘；逆转座子缺失及附近区域的组学特征分析；逆转座子转录本与基因组互作调控；逆转座子缺失与差异表达基因的联系，以及逆转座子缺失的生物功能。.严格遵循研究内容和研究计划，取得了如下的研究成果：.正常细胞的体细胞单细胞变异数据库。通过深入挖掘胚胎成纤维细胞、脂肪祖细胞和间充质干细胞等正常细胞单细胞基因组数据，绘制了各类型正常细胞的体细胞基因组遗传变异图谱，总共涉及体细胞突变80万个，基于这些体细胞突变，建立了正常细胞的体细胞变异数据库，为后续研究细胞异质性及相应的调控机制提供了宝贵资料，该研究工作已在Nucleic Acids Research杂志发表。.逆转座子相关的转录本在基因组的上的调控情况。结合最新的检测RNA与DNA互作的交联测序技术GRID-seq和MARGI，揭示同源缺失的逆转座子与DNA存在显著的互作。并且结合的DNA主要分布在基因间区的增强子和启动子区，内含子区和基因组重复序列区域。另外，同源逆转座子的转录本的靶标区域，有更少的GC含量，进而表明这些与染色质结合的RNA可能并不是促进异染色质的形成，而更可能是为了保持染色体的开放程度，从而调控基因的表达，从而证实了同源逆转座子的转录本参与了反式调控基因的表达。.小鼠早期胚胎发育过程中基于逆转座子的转录异质性研究。我们对C57BL6/129SV 品系小鼠早期胚胎发育各阶段的单细胞转录组进行分析，显示无论是逆转座子表达情况，还是整体转录本表达情况，在囊胚阶段都表现出更大的异质性和波动性，而转录组共表达分析显示部分基因的顺式调控原件与逆转座子转录本存在互作，功能分析显示此类基因参与了胚胎神经管鞘的发育。从而从转录组水平揭示了逆转座子在小鼠早期胚胎发育过程中的调控作用。