益生菌转Lux基因生物发光模型的构建及功能性研究

为满足益生菌在动物消化道内检测研究需要，本研究将lux生物发光基因引入益生菌研究领域。通过克隆lux基因、重组和构建发光基因载体（质粒、转座子），经生物转化将lux基因转入双歧杆菌(Bifidobacterium)和乳酸杆菌(Lactobacillus )等主要益生菌中，构建热稳定性好、灵敏度高、发光能力强的生物工程发光益生菌模型，并以小鼠为动物试验模型，通过生物发光检测技术探明该发光益生菌在动物消化道内的黏附、定植部位、分布情况、生长繁殖动态变化、外部环境对其发光强度的影响等，揭示益生菌对宿主的益生效应及作用机理，使lux报告基因系统的快速、灵敏、无伤害及易于检测等特点在益生菌的功能性研究领域得到利用。此项目的实施完成，为即时直观监测益生菌在动物体内的动态变化、筛选鉴定益生菌及研究其益生功能提供新的研究方法和理论依据，对益生菌功能性产品的安全研发和科学管理具有重要意义。

本项目充分利用lux报告基因系统的快速、灵敏、无伤害及易于检测等特点将lux报告基因生物发光技术应用于益生菌功能研究领域。通过克隆明亮发光杆菌、费氏弧菌等重要发光菌及具有自主产权的青海弧菌（vibrio qinghaiensis）lux基因，重组（质粒、转座子）和构建发光基因载体，经生物转化将lux基因转入双歧杆菌和乳酸杆菌等主要益生菌中，试图构建热稳定性好、灵敏度高、发光能力强的生物工程发光益生菌模型，通过生物发光检测技术探明该发光益生菌在动物消化道内的黏附、定植部位、分布情况、生长繁殖动态变化、外部环境对其发光强度的影响等，揭示益生菌对宿主的益生效应及作用机理。.主要研究内容：. 参考和使用已有的相关表达载体，通过克隆lux基因,构建可以在益生菌中表达生物发光基因载体，并探索生物转化的技术参数。研究转基因工程菌模型的生长、发酵、发光、耐热、耐酸等特性。以乳酸菌 (Lactobacillus acidophilus）和双歧杆菌为目标益生菌，通过生物转化将载体成功转入，并获得高表达的转基因益生菌生物模型。研究益生菌转基因生物发光模型在动物消化道内的粘附、生长变化规律和定植情况，以及外部环境变化对益生菌在动物体内生长、定植等的影响。.重要结果：. 成功克隆了青海弧菌16SrDNA、luxCDABE、luxAB基因，探究了青海弧菌及其荧光素酶基因的进化亲缘性，将luxCDABE、luxAB构建重组质粒，并进行原核表达，发现青海弧菌生化表现和霍乱弧菌及哈氏弧菌相似度较高。比对不同来源（lux）基因不同发光细菌（青海弧菌和发光光杆状菌）中lux基因的表达特性差异，证实青海弧菌的发光虽然可以在低浓度盐溶液中进行但是其高温特性不稳定。构建lux基因的转座子质粒，但其筛选难度大，表达稳定性差，构建转 luxCDABE 基因发光乳球菌和转luxAB 基因发光乳球菌，并研究相关发光特性及外部环境条件对其发光特性的影响。.科学意义：. lux报告基因生物发光技术已经被广泛应用于诸多研究领域，被证明是一种有效的、多功能的生物学分析工具。此项目的实施，拓展了发光菌及报告基因（lux）在食品安全及微生物功能性研究方面的作用，为深入研究提供新的研究方法和理论依据，对益生菌功能性产品的安全研发和科学管理具有重要意义。